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摘 要：為研究海滨锦葵提取物对异育银鲫生长性能及非特异性免疫的影响，以异育银鲫幼鱼为试验对象，在其基础日粮中添加不同水平的海滨锦葵提取物，研究不同水平海滨锦葵提取物对其生长性能、超氧化物歧化酶、溶菌酶、过氧化氢酶活性及丙二醛含量的影响。结果表明，试验组饲料系数显著降低，可有效提高异育银鲫的免疫机能和生长性能。
关键词：海滨锦葵;异育银鲫;非特异性免疫;生长性能;提取物
中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）16-0015-03
Abstract：In order to study the effects of extracts of Kostelezkya virginica on growth performance and non-specific immunity of allogynous crucian carp. Different levels of extracts of Kostelezkya virginica were added to the basic diets of allogynous crucian carp. The control group did not add extracts of mallow，the basic diets of treatment group （group I～IV） were added 40 g，80 g，120 g and 160g extracts of Kostelezkya virginica in turn per ton. The effects of different levels extracts of Kostelezkya virginica on its growth performance，superoxide dismutase，lysozyme，catalase activity and malondialdehyde content were studied. The results showed that the growth performance of allogynous silver crucian carp could be improved in the test group，and the best effect was found in the test group II. Compared with the control group，the feed coefficient decreased significantly to 1.56（P<0.05），17.46% （p < 0.05），44.08%（P<0.05），62.03%（P<0.05），catalase activity increased by 44.44%（P<0.05），and malondialdehyde content decreased by 58.48%（P<0.05）. Therefore，the Kostelezkya virginica extracts can effectively improve the immune function and growth performance of allogynous silver crucian carp，and the optimum dosage is 80 mg/kg.
Key words：Kostelezkya virginica;Allogynous silver crucian carp;Non-specific Immune;Growth Performance;Extracts
海滨锦葵（Kostelezkya virginica）是锦葵科锦葵属草本植物，天然分布于美国东部沿海的特拉华州至得克萨斯州的盐沼海岸带，1993年由南京大学钦佩教授引入中国，并经实验室及野外生理生态试验证明其活性成分对哺乳动物无毒且无致突变作用，其提取物可安全应用[1-2]。海滨锦葵块根和叶片中富含无糖、皂苷、黄酮等生物活性成分，具有很好的增强免疫和抗肿瘤作用。运用海滨锦葵根粉或叶片为原料提取有效成分，针对畜禽和水产的不同养殖阶段开发不同类型饲用免疫增强剂，提高集约化养殖的畜禽和水产动物免疫力，完全或大部分替代抗生素，在促进养殖效益提高的同时，为市场提供安全的养殖食品。
随着人们对畜禽和水产类食品安全性不断重视，纯天然、绿色、安全的饲用添加剂的需求量将逐步提高。国内现有的植物源饲用添加剂主要以中草药为主，其种植加工成本偏高和用量偏大限制了市场的需求。如黄芪等中草药原料植物需要良田种植，在水肥条件保证的情况下，黄芪药用部分根的产量为3750～4500kg/hm2，而市场需求的黄芪多糖需要进一步加工，有效应用剂量为1‰以上。其他的植物源饲用添加剂仍在研发之中，尚未形成市场规模，导致增强畜禽和水产机体免疫力的添加剂仍然以抗生素类为主。海滨锦葵体内富含多种生物活性物质，其含量明显超过其他一般中草药，在饲料中低用量添加即可起到显著效果，具有纯天然、绿色安全、成本低、效益好的优势，可运用于绿色饲用添加剂。本研究旨在将海滨锦葵提取物作为饲用添加剂添加至异育银鲫饲料中，通过考察其对异育银鲫的生长性能和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、溶菌酶（Lysozym，LZM）、过氧化氢酶（Catalase from bovine liver，CAT）活性及丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）等非特异性免疫指标的影响，以期获得海滨锦葵提取物在异育银鲫基础日粮最佳添加水平，为开发天然、绿色、安全的饲用免疫增强剂与促生长添加剂提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 异育银鲫，体重量30～40g，试验前经驯养2周，淘汰体质弱及带病个体，由宿迁三新农业有限公司提供;海滨锦葵提取物，活性成分含多糖、皂苷、黄酮（根粉多糖≥10.00%、根粉皂苷≥3.50%、根粉黄酮≥0.50%），由江苏海力发生物科技有限公司提供;超氧化物歧化酶活试剂盒、过氧化氢酶活试剂盒、丙二醛测定试剂盒、溶壁球菌粉，均购于南京建成生物工程研究所;试验用缸：玻璃钢材质，圆柱体水槽，高度90cm，直径90cm，淮安正昌饲料有限公司提供。
1.2 主要仪器 MIX1000型旋涡混合仪（ 杭州瑞成仪器有限公司），HWS-12电热恒温水浴锅（上海一恒仪器有限公司），Alpha-1900Plus紫外可见光分光光度计（上海谱元仪器有限公司），AXTGL16A台式高速冷冻离心机（ 盐城市安信实验仪器有限公司）。
1.3 日粮配方组成 以淮安正昌饲料有限公司异育银鲫幼鱼饲料为基础日粮，对照组不添加海滨锦葵提取物，试验组（Ⅰ～Ⅳ组）每吨依次分别添加40g、80g、120g和160g的海滨锦葵提取物。对照组与试验组日粮配方组成与营养水平见表1、表2。
1.4 养殖试验 选择体质健壮、大小基本一致的经驯养后的异育银鲫鱼种为试验对象，每缸投放40尾，每组试验各设3个重复，共15缸。采用淮安正昌饲料有限公司恒温循环水养殖系统，水温控制在25±1℃，溶解氧保持在5.0mg/L以上，氨氮小于0.3mg/L，pH约为7.0，昼夜充气，每隔2d换水1次，每次换水2/3，以保证水质清新。饲料投喂量根据鱼体重及驯养时实际摄食量确定，投喂量约为体重的4.0%～4.5%。每2周称重1次，同时调整投饲量。每日定点定时投喂4次，时间为8∶00，11∶00，13∶00，17∶00，饱食投喂，观察摄食情况。养殖周期91d，记录初均体重量、末均体重量、末均体长、总投饵量、总残饵量，计算饲料系数、体重增长率和肥满度。
1.5 生长性能指标计算方法[3] 体重增长率（%）=[（末均体重量-初均体重量）/初均体重量×100]; （1）
饲料系数=（总投饵量-总残饵量）/（末均体[重]量-初均体[重]量）; （2）
肥满度（%）=末均体[重]量（g）/末均体长3（cm3）×100; （3）
1.6 血清非特异性免疫指标[4-6] 饲养试验结束后，每缸随机取鱼3尾，于尾静脉处采血，置于2mL离心管中，于4℃、3000r/min下，离心10min，收集上层血清，-18℃冰箱冷冻，备用，分别用于测定SOD、CAT、LZM活性和MDA含量。
1.6.1 SOD活性测定 采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，使用购自南京建成生物技术研究所的SOD测试盒进行测定，操作步骤参考试剂盒步骤进行。按下公式计算的超氧化物歧化酶活性：
1.6.2 LZM活性測定 参考王锐[7]的方法进行，略有改动，用0.067mol/L，pH6.4的磷酸盐缓冲液溶解溶壁微球菌粉制成0.2mg/mL的菌悬液。每个样品取3.0mL菌悬液，吸取血清0.04mL加入到菌悬液中，立即混匀并在540nm下测定吸光值A0。然后在30℃水浴中保温20min，取出后置于4℃冰浴中终止反应，再次测定吸光值A。按下公式计算溶菌酶的活性U：[U=（A0-A）/A0]。
1.6.3 MDA含量测定 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定丙二醛含量，测定步骤按照试剂盒说明书操作。样品中MDA含量按以下公式计算：
1.6.4 CAT活性测定 采用钼酸铵法测定CAT活性，使用购自南京建成生物技术研究所的CAT测试盒进行测定，操作步骤参考试剂盒步骤进行。
1.7 数据处理方法 采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析、Duncan法多重比较。试验数据采用平均值±标准差来表示，显著性水平为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 对生长性能的影响 由表3可知，添加海滨锦葵提取物试验组与对照组相比，末体均重和体重增长率均有显著提高（P<0.05），饲料系数均显著降低（P<0.05）而肥满度差异不显著（P>0.05）。其中添加量为80-120mg/kg饲料的试验Ⅱ、Ⅲ组，体重增长率极显著高于其他试验组（P<0.01），饲料系数极显著低于其他试验组（P<0.01）。试验Ⅱ、Ⅲ组体重增长率相比对照组分别提高了31.27%和28.54%，饲料系数由对照组的1.89降低至1.56和1.59，分别降低了17.46%和15.87%，因此试验Ⅱ、Ⅲ组海滨锦葵添加量显著提高了异育银鲫的生产性能。综合考虑生长性能及生产成本，每吨配合饲料中的海滨锦葵提取物的添加量以80g为宜。
2.2 对血清非特异性免疫指标的影响 由表4可知，相比对照组，试验Ⅰ～Ⅳ组血清中SOD、CAT和LZM活性均显著提高（P<0.05），而试验组MDA含量均显著低于对照组（P<0.05）。其中试验Ⅱ组Ⅲ组的4项指标差异极显著，SOD活性分别提高了44.08%和38.57%，CAT酶活分别提高了62.03%和55.59%，LZM分别提高了44.44%和42.22%，而MDA含量分别降低了58.48%和57.67%。由此可见，向异育银鲫配合饲料中添加一定量的海滨锦葵提取物，显著提高了异育银鲫的免疫力，其中以每吨配合饲料添加80g海滨锦葵提取物能最有效提高异育银鲫的免疫力。
3 结论与讨论
鱼类血清中SOD、CAT、LZM活性及MDA含量是衡量鱼类非特异性免疫力的主要评价指标。其中SOD是鱼体重要的抗氧化酶，其主要功能是清除体内自由基;CAT是鱼体防御体系的关键酶之一，其主要功能是分解鱼体内的H2O2，生成H2O，从而使机体避免H2O2的毒害;MDA是鱼体内脂质过氧化反应的氧化终产物，脂质过氧化会引起细胞损伤，因此血液中丙二醛的含量可以间接地反映机体内细胞的损伤程度[4]。而鱼类血清中LZM主要针对G+菌发挥作用，对一些G-菌如伤寒杆菌、嗜水气单胞菌等也有作用，在防御病原入侵上起着重要作用，在鱼类的非特异性免疫中也起着至关重要的作用[7]。本研究向异育银鲫配合饲料中添加不同水平的海滨锦葵提取物，考察其对异育银鲫生长性能及非特异性免疫指标的影响，综合考虑生长性能和生产成本，确定了每吨配合饲料中添加80g海滨锦葵提取物可以最有效提高异育银鲫的免疫机能，从而大大提高了异育银鲫的生产性能。因此，本研究成果将为海滨锦葵提取物在动物饲料中的应用提供了数据基础，具有一定的现实意义。
参考文献
[1]孙建国，张焕仕，宰学明，等.耐盐经济植物海滨锦葵综合利用研究进展[J].江苏农业科学，2015，43（10）：440-442.
[2]仲昭朝，张焕仕，张鹤云，等.海滨锦葵块根生物活性成分的动态分析及其降血尿酸活性研究[J].天然产物研究与开发，2017，29：371-395，399.
[3]胡佩红，窦勇，陈权文，等.膨化饲料能蛋比对黄颡鱼生长性能的影响[J].农业科技与装备，2017，（5）：38-41.
[4]孙飞，何杰，叶元土，等.壳寡糖对异育银鲫生长性能、肠道组织结构和非特异性免疫功能的影响[J].动物营养学报，2018，30（12）：5153-5163.
[5]董学兴，黄金田，杨文，等.海带及甘蕈酸对异青银鲫生长、表观消化率和非特异性免疫的影响[J].饲料工业，2011，32（8）：26-28.
[6]窦勇，彭聚华，胡佩红，等.低蛋白日粮中添加复合酶制剂对仔猪生产性能、表观消化率及氮排放量的影响[J].河南农业科学，2014，43（9）：146-150，155.
[7]王锐，刘军，刘辉宇，等.半乳甘露寡糖对异育银鲫幼鱼生长和非特异性免疫的影响[J].上海水产大学学报，2008，17（4）：502-506.
（责编：杨 林）
关键词：海滨锦葵;异育银鲫;非特异性免疫;生长性能;提取物
中图分类号 R285 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）16-0015-03
Abstract：In order to study the effects of extracts of Kostelezkya virginica on growth performance and non-specific immunity of allogynous crucian carp. Different levels of extracts of Kostelezkya virginica were added to the basic diets of allogynous crucian carp. The control group did not add extracts of mallow，the basic diets of treatment group （group I～IV） were added 40 g，80 g，120 g and 160g extracts of Kostelezkya virginica in turn per ton. The effects of different levels extracts of Kostelezkya virginica on its growth performance，superoxide dismutase，lysozyme，catalase activity and malondialdehyde content were studied. The results showed that the growth performance of allogynous silver crucian carp could be improved in the test group，and the best effect was found in the test group II. Compared with the control group，the feed coefficient decreased significantly to 1.56（P<0.05），17.46% （p < 0.05），44.08%（P<0.05），62.03%（P<0.05），catalase activity increased by 44.44%（P<0.05），and malondialdehyde content decreased by 58.48%（P<0.05）. Therefore，the Kostelezkya virginica extracts can effectively improve the immune function and growth performance of allogynous silver crucian carp，and the optimum dosage is 80 mg/kg.
Key words：Kostelezkya virginica;Allogynous silver crucian carp;Non-specific Immune;Growth Performance;Extracts
海滨锦葵（Kostelezkya virginica）是锦葵科锦葵属草本植物，天然分布于美国东部沿海的特拉华州至得克萨斯州的盐沼海岸带，1993年由南京大学钦佩教授引入中国，并经实验室及野外生理生态试验证明其活性成分对哺乳动物无毒且无致突变作用，其提取物可安全应用[1-2]。海滨锦葵块根和叶片中富含无糖、皂苷、黄酮等生物活性成分，具有很好的增强免疫和抗肿瘤作用。运用海滨锦葵根粉或叶片为原料提取有效成分，针对畜禽和水产的不同养殖阶段开发不同类型饲用免疫增强剂，提高集约化养殖的畜禽和水产动物免疫力，完全或大部分替代抗生素，在促进养殖效益提高的同时，为市场提供安全的养殖食品。
随着人们对畜禽和水产类食品安全性不断重视，纯天然、绿色、安全的饲用添加剂的需求量将逐步提高。国内现有的植物源饲用添加剂主要以中草药为主，其种植加工成本偏高和用量偏大限制了市场的需求。如黄芪等中草药原料植物需要良田种植，在水肥条件保证的情况下，黄芪药用部分根的产量为3750～4500kg/hm2，而市场需求的黄芪多糖需要进一步加工，有效应用剂量为1‰以上。其他的植物源饲用添加剂仍在研发之中，尚未形成市场规模，导致增强畜禽和水产机体免疫力的添加剂仍然以抗生素类为主。海滨锦葵体内富含多种生物活性物质，其含量明显超过其他一般中草药，在饲料中低用量添加即可起到显著效果，具有纯天然、绿色安全、成本低、效益好的优势，可运用于绿色饲用添加剂。本研究旨在将海滨锦葵提取物作为饲用添加剂添加至异育银鲫饲料中，通过考察其对异育银鲫的生长性能和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、溶菌酶（Lysozym，LZM）、过氧化氢酶（Catalase from bovine liver，CAT）活性及丙二醛（Malonic dialdehyde，MDA）等非特异性免疫指标的影响，以期获得海滨锦葵提取物在异育银鲫基础日粮最佳添加水平，为开发天然、绿色、安全的饲用免疫增强剂与促生长添加剂提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 异育银鲫，体重量30～40g，试验前经驯养2周，淘汰体质弱及带病个体，由宿迁三新农业有限公司提供;海滨锦葵提取物，活性成分含多糖、皂苷、黄酮（根粉多糖≥10.00%、根粉皂苷≥3.50%、根粉黄酮≥0.50%），由江苏海力发生物科技有限公司提供;超氧化物歧化酶活试剂盒、过氧化氢酶活试剂盒、丙二醛测定试剂盒、溶壁球菌粉，均购于南京建成生物工程研究所;试验用缸：玻璃钢材质，圆柱体水槽，高度90cm，直径90cm，淮安正昌饲料有限公司提供。
1.2 主要仪器 MIX1000型旋涡混合仪（ 杭州瑞成仪器有限公司），HWS-12电热恒温水浴锅（上海一恒仪器有限公司），Alpha-1900Plus紫外可见光分光光度计（上海谱元仪器有限公司），AXTGL16A台式高速冷冻离心机（ 盐城市安信实验仪器有限公司）。
1.3 日粮配方组成 以淮安正昌饲料有限公司异育银鲫幼鱼饲料为基础日粮，对照组不添加海滨锦葵提取物，试验组（Ⅰ～Ⅳ组）每吨依次分别添加40g、80g、120g和160g的海滨锦葵提取物。对照组与试验组日粮配方组成与营养水平见表1、表2。
1.4 养殖试验 选择体质健壮、大小基本一致的经驯养后的异育银鲫鱼种为试验对象，每缸投放40尾，每组试验各设3个重复，共15缸。采用淮安正昌饲料有限公司恒温循环水养殖系统，水温控制在25±1℃，溶解氧保持在5.0mg/L以上，氨氮小于0.3mg/L，pH约为7.0，昼夜充气，每隔2d换水1次，每次换水2/3，以保证水质清新。饲料投喂量根据鱼体重及驯养时实际摄食量确定，投喂量约为体重的4.0%～4.5%。每2周称重1次，同时调整投饲量。每日定点定时投喂4次，时间为8∶00，11∶00，13∶00，17∶00，饱食投喂，观察摄食情况。养殖周期91d，记录初均体重量、末均体重量、末均体长、总投饵量、总残饵量，计算饲料系数、体重增长率和肥满度。
1.5 生长性能指标计算方法[3] 体重增长率（%）=[（末均体重量-初均体重量）/初均体重量×100]; （1）
饲料系数=（总投饵量-总残饵量）/（末均体[重]量-初均体[重]量）; （2）
肥满度（%）=末均体[重]量（g）/末均体长3（cm3）×100; （3）
1.6 血清非特异性免疫指标[4-6] 饲养试验结束后，每缸随机取鱼3尾，于尾静脉处采血，置于2mL离心管中，于4℃、3000r/min下，离心10min，收集上层血清，-18℃冰箱冷冻，备用，分别用于测定SOD、CAT、LZM活性和MDA含量。
1.6.1 SOD活性测定 采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，使用购自南京建成生物技术研究所的SOD测试盒进行测定，操作步骤参考试剂盒步骤进行。按下公式计算的超氧化物歧化酶活性：
1.6.2 LZM活性測定 参考王锐[7]的方法进行，略有改动，用0.067mol/L，pH6.4的磷酸盐缓冲液溶解溶壁微球菌粉制成0.2mg/mL的菌悬液。每个样品取3.0mL菌悬液，吸取血清0.04mL加入到菌悬液中，立即混匀并在540nm下测定吸光值A0。然后在30℃水浴中保温20min，取出后置于4℃冰浴中终止反应，再次测定吸光值A。按下公式计算溶菌酶的活性U：[U=（A0-A）/A0]。
1.6.3 MDA含量测定 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定丙二醛含量，测定步骤按照试剂盒说明书操作。样品中MDA含量按以下公式计算：
1.6.4 CAT活性测定 采用钼酸铵法测定CAT活性，使用购自南京建成生物技术研究所的CAT测试盒进行测定，操作步骤参考试剂盒步骤进行。
1.7 数据处理方法 采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析、Duncan法多重比较。试验数据采用平均值±标准差来表示，显著性水平为P<0.05。
2 结果与分析
2.1 对生长性能的影响 由表3可知，添加海滨锦葵提取物试验组与对照组相比，末体均重和体重增长率均有显著提高（P<0.05），饲料系数均显著降低（P<0.05）而肥满度差异不显著（P>0.05）。其中添加量为80-120mg/kg饲料的试验Ⅱ、Ⅲ组，体重增长率极显著高于其他试验组（P<0.01），饲料系数极显著低于其他试验组（P<0.01）。试验Ⅱ、Ⅲ组体重增长率相比对照组分别提高了31.27%和28.54%，饲料系数由对照组的1.89降低至1.56和1.59，分别降低了17.46%和15.87%，因此试验Ⅱ、Ⅲ组海滨锦葵添加量显著提高了异育银鲫的生产性能。综合考虑生长性能及生产成本，每吨配合饲料中的海滨锦葵提取物的添加量以80g为宜。
2.2 对血清非特异性免疫指标的影响 由表4可知，相比对照组，试验Ⅰ～Ⅳ组血清中SOD、CAT和LZM活性均显著提高（P<0.05），而试验组MDA含量均显著低于对照组（P<0.05）。其中试验Ⅱ组Ⅲ组的4项指标差异极显著，SOD活性分别提高了44.08%和38.57%，CAT酶活分别提高了62.03%和55.59%，LZM分别提高了44.44%和42.22%，而MDA含量分别降低了58.48%和57.67%。由此可见，向异育银鲫配合饲料中添加一定量的海滨锦葵提取物，显著提高了异育银鲫的免疫力，其中以每吨配合饲料添加80g海滨锦葵提取物能最有效提高异育银鲫的免疫力。
3 结论与讨论
鱼类血清中SOD、CAT、LZM活性及MDA含量是衡量鱼类非特异性免疫力的主要评价指标。其中SOD是鱼体重要的抗氧化酶，其主要功能是清除体内自由基;CAT是鱼体防御体系的关键酶之一，其主要功能是分解鱼体内的H2O2，生成H2O，从而使机体避免H2O2的毒害;MDA是鱼体内脂质过氧化反应的氧化终产物，脂质过氧化会引起细胞损伤，因此血液中丙二醛的含量可以间接地反映机体内细胞的损伤程度[4]。而鱼类血清中LZM主要针对G+菌发挥作用，对一些G-菌如伤寒杆菌、嗜水气单胞菌等也有作用，在防御病原入侵上起着重要作用，在鱼类的非特异性免疫中也起着至关重要的作用[7]。本研究向异育银鲫配合饲料中添加不同水平的海滨锦葵提取物，考察其对异育银鲫生长性能及非特异性免疫指标的影响，综合考虑生长性能和生产成本，确定了每吨配合饲料中添加80g海滨锦葵提取物可以最有效提高异育银鲫的免疫机能，从而大大提高了异育银鲫的生产性能。因此，本研究成果将为海滨锦葵提取物在动物饲料中的应用提供了数据基础，具有一定的现实意义。
参考文献
[1]孙建国，张焕仕，宰学明，等.耐盐经济植物海滨锦葵综合利用研究进展[J].江苏农业科学，2015，43（10）：440-442.
[2]仲昭朝，张焕仕，张鹤云，等.海滨锦葵块根生物活性成分的动态分析及其降血尿酸活性研究[J].天然产物研究与开发，2017，29：371-395，399.
[3]胡佩红，窦勇，陈权文，等.膨化饲料能蛋比对黄颡鱼生长性能的影响[J].农业科技与装备，2017，（5）：38-41.
[4]孙飞，何杰，叶元土，等.壳寡糖对异育银鲫生长性能、肠道组织结构和非特异性免疫功能的影响[J].动物营养学报，2018，30（12）：5153-5163.
[5]董学兴，黄金田，杨文，等.海带及甘蕈酸对异青银鲫生长、表观消化率和非特异性免疫的影响[J].饲料工业，2011，32（8）：26-28.
[6]窦勇，彭聚华，胡佩红，等.低蛋白日粮中添加复合酶制剂对仔猪生产性能、表观消化率及氮排放量的影响[J].河南农业科学，2014，43（9）：146-150，155.
[7]王锐，刘军，刘辉宇，等.半乳甘露寡糖对异育银鲫幼鱼生长和非特异性免疫的影响[J].上海水产大学学报，2008，17（4）：502-506.
（责编：杨 林）