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[摘 要] 2016年10月，某猪场发生以耳朵发绀、皮肤潮红且有出血斑、呼吸困难、全身淋巴结肿大且有出血点、脾梗死等为主要特征的疫病，通过实验室PCR诊断确诊为猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染。
[关键词] 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 混合感染 PCR诊断
[中图分类号] S858.28 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650（2017）03-0246-01
猪瘟（classical swine fever，CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）分别是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起猪的二种病毒性传染病，均是目前危害我国养猪业的重要传染病，也是我国重点防疫的主要疫病[1]。2016年10月，某猪场发生了一起以发热、食欲减退、精神萎靡、耳朵发绀、皮肤潮红且有出血斑、呼吸困难、全身淋巴结肿大且有出血点、脾梗死等为主要特征的疫病。通过临床特征初步判断为疑似CSFV与PRRSV混合感染，为进一步确定致病原，进行了实验室PCR诊断，现将PCR诊断过程介绍如下。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 One Step RT-PCR Kit购自宝生物（大连）工程有限公司；病毒基因组RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。
1.2 病料样品的采集与处理 采集病死猪的脾脏、肾脏、淋巴结等组织，将其与灭菌生理盐水以1：5（质量体积比）比例混合后，组织捣碎机捣碎、匀浆，离心取上清液即为处理后的病料样品。
1.3 基因组RNA的提取 利用病毒基因组RNA提取试剂盒提取病料样品的基因组RNA。
1.4 引物设计与合成
参照参考文献[2]合成1对CSFV强毒株检测引物（上游引物：5’-ATCAGTCTCTGGAATTGTTGGCA-3’；下游引物：5’-CAAGCACGGATGAGGAATGCCG -3’），该对引物可对CSFV强毒株扩增出187 bp特异性条带，对CSFV弱毒疫苗株无扩增产物。参照参考文献[3]合成1对PRRSV鉴别检测引物（上游引物：5’-CCCTCCACCAAGAGTTCAACC-3’；下游引物：5’-TTCAGTATATCCGAGATTCCA-3’），该对引物可对高致病性PRRSV扩增出459 bp特异性条带，对PRRSV经典毒株增出549 bp特异性条带。
1.5 RT-PCR扩增 分别利用CSFV、PRRSV检测引物对病料样品基因组RNA进行一步法RT-PCR检测。CSFV、PRRSV一步法RT-PCR扩增体系均为：2×One Step Buffer 12.5?L、One Sep enzyme Mix 0.5μL，上、下游引物各0.5?L，RNA 5μL，H2O 6μL。CSFV一步法RT-PCR扩增程序为：50℃ 30min，94℃ 5min，94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s、30个循环，72℃ 10min。PRRSV一步法RT-PCR扩增程序为：50℃ 50min，94 ℃ 5min，94℃ 45s、56℃ 45s、72℃ 45s、30个循环，72℃ 10min。
1.6 RT-PCR扩增结果的检测 取RT-PCR扩增产物进行1.5 %琼脂糖凝胶电泳，根据有无特异性条带以及条带大小判定检测结果。
2 结果与分析
如图1所示，CSFV强毒株检测引物扩增出1条约189 bp特异性条带，与预期CSFV强毒株扩增片段大小相符；PRRSV鉴别检测引物扩增出1条约459 bp特异性条带，与预期高致病性PRRSV扩增片段大小相符。表明此次疫病主要由CSFV强毒株和高致病性PRRSV混合感染所致。
3 讨论
PRRS是猪的一种重要免疫抑制病，可导致猪群免疫力和抗病力下降，进而混合感染其它致病原，导致病情加重，且增加临床诊断难度。PCR检测作为一种核苷酸體外快速扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点，是目前动物疫病广泛使用的诊断方法。本病例在常规PCR技术的基础上，采用了近几年才商品化的One Step RT-PCR Kit，使反转录反应与PCR扩增反应一步完成，虽然使用商品化试剂盒提高了检测成本，但也大大节省了检测时间和操作步骤，降低了污染概率，也使检测结果更加准确、可靠。本病例通过一步法RT-PCR扩增方法确诊致病原为CSFV和PRRSV混合感染，为养殖场采取治疗措施赢得了时间，养殖场虽然通过采取隔离饲养、消毒、疫苗免疫接种等系列措施迅速控制了疫情，将经济损失降至了最低，但笔者仍建议养殖单位平时要做好CSF、PRRS等常见疫病的疫苗免疫和抗体监测工作，确保疫苗免疫效果，保持猪群有整体的、较高的免疫抗体水平，避免免疫失败，做到从源头上预防和控制CSF、PRRS等主要疫病。
参考文献
[1]杨凡，吕文婷，许思遥，等. 2014-2016年四川省猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒的血清学调查[J].猪业科学，2017，34（1）：106-109.
[2]郭抗抗，邓力，井勇，等. 猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鑒别检测方法的建立[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，38（6）：13-18.
[3]王维忠. 猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT- PCR鉴别诊断方法的建立及应用[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（8）：76-79.
[关键词] 猪瘟病毒 猪繁殖与呼吸综合征病毒 混合感染 PCR诊断
[中图分类号] S858.28 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650（2017）03-0246-01
猪瘟（classical swine fever，CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）分别是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起猪的二种病毒性传染病，均是目前危害我国养猪业的重要传染病，也是我国重点防疫的主要疫病[1]。2016年10月，某猪场发生了一起以发热、食欲减退、精神萎靡、耳朵发绀、皮肤潮红且有出血斑、呼吸困难、全身淋巴结肿大且有出血点、脾梗死等为主要特征的疫病。通过临床特征初步判断为疑似CSFV与PRRSV混合感染，为进一步确定致病原，进行了实验室PCR诊断，现将PCR诊断过程介绍如下。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 One Step RT-PCR Kit购自宝生物（大连）工程有限公司；病毒基因组RNA提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司。
1.2 病料样品的采集与处理 采集病死猪的脾脏、肾脏、淋巴结等组织，将其与灭菌生理盐水以1：5（质量体积比）比例混合后，组织捣碎机捣碎、匀浆，离心取上清液即为处理后的病料样品。
1.3 基因组RNA的提取 利用病毒基因组RNA提取试剂盒提取病料样品的基因组RNA。
1.4 引物设计与合成
参照参考文献[2]合成1对CSFV强毒株检测引物（上游引物：5’-ATCAGTCTCTGGAATTGTTGGCA-3’；下游引物：5’-CAAGCACGGATGAGGAATGCCG -3’），该对引物可对CSFV强毒株扩增出187 bp特异性条带，对CSFV弱毒疫苗株无扩增产物。参照参考文献[3]合成1对PRRSV鉴别检测引物（上游引物：5’-CCCTCCACCAAGAGTTCAACC-3’；下游引物：5’-TTCAGTATATCCGAGATTCCA-3’），该对引物可对高致病性PRRSV扩增出459 bp特异性条带，对PRRSV经典毒株增出549 bp特异性条带。
1.5 RT-PCR扩增 分别利用CSFV、PRRSV检测引物对病料样品基因组RNA进行一步法RT-PCR检测。CSFV、PRRSV一步法RT-PCR扩增体系均为：2×One Step Buffer 12.5?L、One Sep enzyme Mix 0.5μL，上、下游引物各0.5?L，RNA 5μL，H2O 6μL。CSFV一步法RT-PCR扩增程序为：50℃ 30min，94℃ 5min，94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s、30个循环，72℃ 10min。PRRSV一步法RT-PCR扩增程序为：50℃ 50min，94 ℃ 5min，94℃ 45s、56℃ 45s、72℃ 45s、30个循环，72℃ 10min。
1.6 RT-PCR扩增结果的检测 取RT-PCR扩增产物进行1.5 %琼脂糖凝胶电泳，根据有无特异性条带以及条带大小判定检测结果。
2 结果与分析
如图1所示，CSFV强毒株检测引物扩增出1条约189 bp特异性条带，与预期CSFV强毒株扩增片段大小相符；PRRSV鉴别检测引物扩增出1条约459 bp特异性条带，与预期高致病性PRRSV扩增片段大小相符。表明此次疫病主要由CSFV强毒株和高致病性PRRSV混合感染所致。
3 讨论
PRRS是猪的一种重要免疫抑制病，可导致猪群免疫力和抗病力下降，进而混合感染其它致病原，导致病情加重，且增加临床诊断难度。PCR检测作为一种核苷酸體外快速扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点，是目前动物疫病广泛使用的诊断方法。本病例在常规PCR技术的基础上，采用了近几年才商品化的One Step RT-PCR Kit，使反转录反应与PCR扩增反应一步完成，虽然使用商品化试剂盒提高了检测成本，但也大大节省了检测时间和操作步骤，降低了污染概率，也使检测结果更加准确、可靠。本病例通过一步法RT-PCR扩增方法确诊致病原为CSFV和PRRSV混合感染，为养殖场采取治疗措施赢得了时间，养殖场虽然通过采取隔离饲养、消毒、疫苗免疫接种等系列措施迅速控制了疫情，将经济损失降至了最低，但笔者仍建议养殖单位平时要做好CSF、PRRS等常见疫病的疫苗免疫和抗体监测工作，确保疫苗免疫效果，保持猪群有整体的、较高的免疫抗体水平，避免免疫失败，做到从源头上预防和控制CSF、PRRS等主要疫病。
参考文献
[1]杨凡，吕文婷，许思遥，等. 2014-2016年四川省猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒的血清学调查[J].猪业科学，2017，34（1）：106-109.
[2]郭抗抗，邓力，井勇，等. 猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鑒别检测方法的建立[J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，38（6）：13-18.
[3]王维忠. 猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT- PCR鉴别诊断方法的建立及应用[J]. 中国畜牧兽医，2012，39（8）：76-79.