论文部分内容阅读
【摘 要】 通过试验，确认所采用方法适用于诺氟沙星胶囊微生物限度检查。方法：按品种项下微生物限度检查规定对每一试验菌逐一进行验证。结果：诺氟沙星胶囊的微生物限度检查过程需要消除其抑菌性。结论：采用低速离心和薄膜过滤（加入硫酸锰溶液中和）的方法用于诺氟沙星胶囊的微生物限度检查。
【关键词】 诺氟沙星胶囊 微生物限度检查
Abstract ： The paper is mainly about the study of the validation of obvious capsule microbial limit inspection methodology.
1.验证材料：
1.1供试品：诺氟沙星胶囊（0.25g）（批号为：A201009220 A201009221 A201009222）。
1.2培养基及试液：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、乳糖胆盐培养基、改良马丁、四硫磺酸钠、胆盐硫乳琼脂 、曙红亚甲蓝琼脂、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、硫酸锰溶液（0.1mol /L，分析纯）。
1.3菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、 黑曲霉
1.4仪器：电热恒温水浴锅、电动离心沉淀机。
2.验证步骤：
1菌液的制备：
2.1.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24小时，分别取各菌种培养液1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释，金黄色葡萄球菌稀释至10-5，大肠埃希菌稀释至10-7，枯草芽孢杆菌稀释至10-5，约为50～100cfu/ml，备用。
2.1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24～48小时，取培养液1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释至10-6，约为50～100 cfu/ml，备用。
2.1.3取黑曲霉的新鲜培养物用5ml0.9%无菌氯化钠溶液适量与标准比浊管进行比较，取比浊后的菌悬液1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中， 10倍依次稀释至10-4， 约为50～100 cfu/ml，备用。
2.2供试液制备：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，水浴（45℃）保温振摇，分散混匀，作为 1：10的供试液。
2.3细菌、霉菌及酵母菌数计数验证试验
2.3.1试验组：
（1）取规定量的供试液，置无菌条件离心（500转/分）3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至原量，混匀后取 1ml加至100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，并向其中加入0.1mol/L的硫酸锰溶液10ml，混匀，然后按照中国药典2010版附录微生物限度检查法中的薄膜过滤法进行过滤，单膜冲洗量1000 ml，并在最后100 ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml，冲洗后取出滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂培养基平板上，置规定条件下培养，每株试验菌平行制备二个平皿。
（2）霉菌、酵母菌计数：采用培养基稀释法。取1：10的供试液0.2ml加至平皿中，并加入试验菌液1ml，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基（温度低于45℃），置规定条件下培养，每株试验菌平行制备二个平皿。
2.3.2菌液组：取稀释好的各菌液1ml，分别加入平皿中，加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养，测定所加的试验菌数。每株试验菌制备二个平皿。
2.3.3供试品对照组：取规定量的供试品，方法同试验组，加入相应的培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。
2.3.4稀释剂对照组：取稀释剂1ml替代供试液，方法同试验组，每株试验菌平行制备2个平皿。
2.3.5试验组回收率（%）=
■×100%
稀释剂对照组菌回收率（%）=
■×100%
2.3.6培养：细菌计数平板30-35℃培养3天；霉菌、酵母菌计数平板23-28℃培养5天，逐日点计菌数。
2.3.7判断标准：稀释剂对照组及试验组的菌回收率应均不低于70%。
三次试验结果见表1、表2、表3。
4.控制菌检查方法的验证：
4.1试验组：取1：10的供试液10ml，置无菌条件离心（500转/分）3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至原量，混匀后转入100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，并向其中加入0.1mol/L的硫酸锰溶液10 ml，混匀，然后按照中国药典附录“微生物限度检查法”中薄膜过滤法进行过滤，冲洗量单膜800 ml，并在最后100 ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml，冲洗后取出滤膜，加至100ml胆盐乳糖培养基中，置30～35℃培养18～24小时。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。沿培养管的管壁加数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
4.2阴性对照组：方法同试验组，加入1ml阴性菌（即金黄色葡萄球菌液，浓度同细菌数验证）。
三次试验结果见表4。
5.结果判断
5.1细菌、霉菌及酵母菌计数验证结论：在三次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，试验组的菌回收率均大于70%，可照此方法测定诺氟沙星胶囊的细菌、霉菌及酵母菌数。
5.2控制菌验证结论：在三次独立的平行试验中，阴性对照组未检出阴性对照菌，试验组检出阳性试验菌，可照此方法进行诺氟沙星胶囊的控制菌检查。
表1 细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（1）
表2 细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（2）
表3 细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（3）
表4 控制菌验证试验结果（1、2、3）
讨论：
以上验证结果表明，诺氟沙星胶囊采用上述方法进行微生物限度检查，霉菌数、酵母菌数测定采用培养基稀释法，细菌数测定采用低速离心（500转/分）3分钟、薄膜过滤（每膜冲洗1000 ml）及加入硫酸锰溶液中和（0.1mol/L的硫酸锰溶液10ml）的方法时，各试验菌的回收率均大于70%，控制菌检查采用低速离心低速离心（500转/分）3分钟、薄膜过滤（单膜冲洗800 ml）及加入硫酸锰溶液中和（0.1mol/L的硫酸锰溶液10ml）。根据中国药典2010年版的相关规定，此方法适用于诺氟沙星胶囊的微生物限度检查。
参考文献：
[1]中国药典2010年版.
[2]药品微生物检验技术 苏德模 马绪荣.
（作者单位：哈药集团制药总厂）
【关键词】 诺氟沙星胶囊 微生物限度检查
Abstract ： The paper is mainly about the study of the validation of obvious capsule microbial limit inspection methodology.
1.验证材料：
1.1供试品：诺氟沙星胶囊（0.25g）（批号为：A201009220 A201009221 A201009222）。
1.2培养基及试液：营养琼脂、玫瑰红钠琼脂、营养肉汤、乳糖胆盐培养基、改良马丁、四硫磺酸钠、胆盐硫乳琼脂 、曙红亚甲蓝琼脂、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、硫酸锰溶液（0.1mol /L，分析纯）。
1.3菌种：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、 黑曲霉
1.4仪器：电热恒温水浴锅、电动离心沉淀机。
2.验证步骤：
1菌液的制备：
2.1.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于30～35℃培养18～24小时，分别取各菌种培养液1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释，金黄色葡萄球菌稀释至10-5，大肠埃希菌稀释至10-7，枯草芽孢杆菌稀释至10-5，约为50～100cfu/ml，备用。
2.1.2接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于23～28℃培养24～48小时，取培养液1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍依次稀释至10-6，约为50～100 cfu/ml，备用。
2.1.3取黑曲霉的新鲜培养物用5ml0.9%无菌氯化钠溶液适量与标准比浊管进行比较，取比浊后的菌悬液1ml加入9ml0.9%无菌氯化钠溶液中， 10倍依次稀释至10-4， 约为50～100 cfu/ml，备用。
2.2供试液制备：取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，水浴（45℃）保温振摇，分散混匀，作为 1：10的供试液。
2.3细菌、霉菌及酵母菌数计数验证试验
2.3.1试验组：
（1）取规定量的供试液，置无菌条件离心（500转/分）3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至原量，混匀后取 1ml加至100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，并向其中加入0.1mol/L的硫酸锰溶液10ml，混匀，然后按照中国药典2010版附录微生物限度检查法中的薄膜过滤法进行过滤，单膜冲洗量1000 ml，并在最后100 ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml，冲洗后取出滤膜，菌面朝上，贴于营养琼脂培养基平板上，置规定条件下培养，每株试验菌平行制备二个平皿。
（2）霉菌、酵母菌计数：采用培养基稀释法。取1：10的供试液0.2ml加至平皿中，并加入试验菌液1ml，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基（温度低于45℃），置规定条件下培养，每株试验菌平行制备二个平皿。
2.3.2菌液组：取稀释好的各菌液1ml，分别加入平皿中，加入营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基，置规定条件培养，测定所加的试验菌数。每株试验菌制备二个平皿。
2.3.3供试品对照组：取规定量的供试品，方法同试验组，加入相应的培养基，每株试验菌平行制备2个平皿。
2.3.4稀释剂对照组：取稀释剂1ml替代供试液，方法同试验组，每株试验菌平行制备2个平皿。
2.3.5试验组回收率（%）=
■×100%
稀释剂对照组菌回收率（%）=
■×100%
2.3.6培养：细菌计数平板30-35℃培养3天；霉菌、酵母菌计数平板23-28℃培养5天，逐日点计菌数。
2.3.7判断标准：稀释剂对照组及试验组的菌回收率应均不低于70%。
三次试验结果见表1、表2、表3。
4.控制菌检查方法的验证：
4.1试验组：取1：10的供试液10ml，置无菌条件离心（500转/分）3分钟，取上清液置无菌试管中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补至原量，混匀后转入100ml PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，并向其中加入0.1mol/L的硫酸锰溶液10 ml，混匀，然后按照中国药典附录“微生物限度检查法”中薄膜过滤法进行过滤，冲洗量单膜800 ml，并在最后100 ml冲洗液中加入相应试验菌液1ml，冲洗后取出滤膜，加至100ml胆盐乳糖培养基中，置30～35℃培养18～24小时。取培养物0.2ml接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。沿培养管的管壁加数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。
4.2阴性对照组：方法同试验组，加入1ml阴性菌（即金黄色葡萄球菌液，浓度同细菌数验证）。
三次试验结果见表4。
5.结果判断
5.1细菌、霉菌及酵母菌计数验证结论：在三次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均大于70%，试验组的菌回收率均大于70%，可照此方法测定诺氟沙星胶囊的细菌、霉菌及酵母菌数。
5.2控制菌验证结论：在三次独立的平行试验中，阴性对照组未检出阴性对照菌，试验组检出阳性试验菌，可照此方法进行诺氟沙星胶囊的控制菌检查。
表1 细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（1）
表2 细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（2）
表3 细菌、霉菌及酵母菌数验证试验结果（3）
表4 控制菌验证试验结果（1、2、3）
讨论：
以上验证结果表明，诺氟沙星胶囊采用上述方法进行微生物限度检查，霉菌数、酵母菌数测定采用培养基稀释法，细菌数测定采用低速离心（500转/分）3分钟、薄膜过滤（每膜冲洗1000 ml）及加入硫酸锰溶液中和（0.1mol/L的硫酸锰溶液10ml）的方法时，各试验菌的回收率均大于70%，控制菌检查采用低速离心低速离心（500转/分）3分钟、薄膜过滤（单膜冲洗800 ml）及加入硫酸锰溶液中和（0.1mol/L的硫酸锰溶液10ml）。根据中国药典2010年版的相关规定，此方法适用于诺氟沙星胶囊的微生物限度检查。
参考文献：
[1]中国药典2010年版.
[2]药品微生物检验技术 苏德模 马绪荣.
（作者单位：哈药集团制药总厂）