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摘要：目的 探讨针刺对脑梗死大鼠骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表达的影响。方法 SD大鼠随机分为空白组、模型组、头部穴位组、躯体穴位组、头部+躯体穴位组，每组15只。采用线栓法建立脑梗死大鼠模型。取穴“百会”、“风府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等，行平补平泻手法。采用Bederson法评估大鼠的行为学变化，采用Western Blotting法检测24h时各组大鼠腓肠肌、前肢肌中Nestin、Cytochrome C蛋白的相对表达量。qRT-PCR法检测0、24、48h时基因的相对表达量。结果 与模型组相比，头部+躯体穴位组行为学评分在0、24、48h时均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组、头部穴位组在24、48h时均有显著性差异（P<0.05）;与模型组比较，头部+躯体穴位组、躯体穴位组腓肠肌Nestin基因在0、24、48h时的表达量均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24、48h有显著性差异（P<0.05）;头部+躯体穴位组、躯体穴位组腓肠肌Cytochrome C基因表达在0、24、48h时的表达均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）;与模型组比较，头部+躯体穴位组前肢肌Nestin基因表达在48h有显著性差异，躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24h有显著性差异（P<0.05）;头部+躯体穴位组、头部穴位组前肢肌Cytochrome C基因在0、24h时的有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05）;各组腓肠肌、前肢肌中Nestin、Cytochrome C蛋白在24h时的表达差异与基因均相一致。结论 针刺可不同程度的上调腓肠肌、前肢肌Nestin蛋白及基因表达，下调Cytochrome C蛋白及基因表达，促进神经功能的修复，改善脑梗死大鼠骨骼肌的功能。
关键词：Nestin;细胞色素C;脑梗死;骨骼肌;针刺
中图分类号：R246 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）11-0071-05
脑梗死是由脑组织局部血液供应障碍，引起缺血、缺氧进而病变坏死的疾病，为临床常见病、多发病，具有起病急、进展快的特点，已成为威胁我国中老年人群身体健康和生命的主要疾病[1]。研究显示，脑梗死可引起不同程度的上运动神经元损害，60%以上的患者会出现偏瘫、失语等后遗症，严重影响患者的生存质量[2]，而肌群功能减弱及废用性萎缩是造成偏瘫、失语发生的主要原因，因此，探索有效的防治方法已成为目前脑梗死患者康复亟需解决的关键问题。巢蛋白（Nestin）是一种神经肌肉接头相关蛋白，研究显示，在缺血性损伤神经修复过程中，Nestin阳性细胞增加，并分化为神经元和神经胶质细胞，从而有利于神经系统结构及功能恢复[3]。细胞色素C是线粒体中一种可溶性促凋亡蛋白，在组织缺血时，释放到胞浆后激活线粒体凋亡程序，是多种细胞凋亡的共同途径，研究显示，抑制细胞色素C的表达可对缺血性损伤后神经元凋亡发挥抑制作用[4-5];针刺疗法在治疗脑梗死后遗症方面有着显著疗效，然而既往针刺相关的基础研究多侧重于神经可塑性及恢复神经细胞功能方面[6]，而忽略了对骨骼肌细胞增殖及凋亡及功能研究，尤其对针刺干预的具体机制阐述不足;本研究通过观察针刺对脑梗死大鼠骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表达水平的影响，旨在揭示针刺在恢复肌肉功能及神经修复中的作用机制，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 SPF级健康雄性SD大鼠，体重240g，共100只，由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SYXK（浙）2014-0008。实验前在实验中心适应性喂养1周，环境条件通風、隔音、自然光照，温度18～26℃、相对湿度50%～60%，自由饮食。对实验动物的各项处理均严格按照2006版《关于善待实验动物的指导性意见》中规定执行。
1.2 主要仪器与试剂 水浴锅（XMTD-6000，上海宜昌仪器纱筛厂）;低温离心机（湘仪实验仪器厂）;实时荧光定量（realtime-PCR）仪（美国ThermoFisher仪器有限公司）;漩涡振荡仪（XH-C，金坛市医疗仪器厂）;针灸针（0.25 mm×13 mm，天和医治器械有限公司）。Anti-Nestin抗体（Thermo Fisher Scientific）、Anti-Cytochrome C抗体（Thermo Fisher Scientific）、BCA蛋白浓度检测试剂盒（北京碧云天公司）、Trizol柱纯化总RNA试剂盒（simgen）;Fast 1st strand cDNA Synthesis Kit（with gDNase）（simgen）、2×SYBR Green PCR Mix（simgen）、50×ROX Reference Dye（simgen）。
1.3 模型制备 脑梗死模型大鼠采用孟宜良的线拴法标准步骤进行制备，在成功结扎颈外动脉远心端和颈总动脉近心端后，大脑中动脉局灶性脑缺血模型即成功[7]，大鼠在自然苏醒后，依照Zea-Longa的5级评分标准评估神经障碍情况[8]，筛选合格模型用于下一步实验。
1.4 动物分组 选取未造模大鼠作为空白对照组，将造模成功的模型大鼠随机分为模型组、头部穴位组、躯体穴位组、头部+躯体穴位组，每组15只。再将各组中模型大鼠2次分组，分为3个亚组用于不同时间点的检测（0、24、48h），每组5只。均给予正常饮食喂养。
1.5 针刺方法 取穴和针刺手法参照华兴邦等研制的《大鼠穴位图谱》，在动物清醒状态下，选用动物一侧“百会”、“风府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等穴，给予针刺捻转1 min，频率（80±5）次/min，平补平泻：“百会”后斜刺2 mm，“风府”下斜刺2 mm，“后三里”直刺7 mm，“前三里”直刺5 mm，“环跳”直刺7 mm，“后会”斜刺2 mm，“阳陵泉”直刺5 mm。针刺1次，留针30 min。所有针刺操作由同一人进行。空白组与模型组不予针刺。 1.6 行为学评分 在针刺治疗后0、24、48h时参照Bederson等[9]改良方法对大鼠行为学变化进行评估。分值为0～4分，0分：未见行为缺陷;1分：前肢屈曲，不能完全伸展;2分：前肢屈曲伴侧推抵抗力下降，无转圈行;3分：前肢屈曲伴侧推抵抗力下降，伴有自发性旋转;4分：意识障碍，不能自主行走。
1.7 标准取材及检测 针刺干预完成后，在对应时间点采用脊椎脱臼法快速处死大鼠，分离前肢肌、腓肠肌针刺局部的骨骼肌，装于冻存管置于液氮中备测。采用Western Blotting法检测针刺治疗后24h时前肢肌、腓肠肌组织中Nestin、Cytochrome C蛋白的表达：按蛋白提取试剂盒说明提取Nestin、Cytochrome C和β-actin的总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定。分别加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤，二抗孵育1 h，TBST洗涤，再加入ECL化学发光试剂进行显影。采用qRT-PCR法检测组织中Nestin、Cytochrome C基因的表达：（1）RNA提取：取肌组织称重后加入裂解液，充分研磨匀浆后，用严格按照Trizol试剂盒提取RNA，具体步骤参照说明书。（2）逆转录合成cDNA：取2 μg上述提取的RNA用于逆转录，稀释10倍后分装备用。（3）PCR扩增：按照实时荧光定量试剂盒操作步骤，上机进行扩增实验，扩增条件为如下：95℃ 1 min，预变性;95℃ 5s，60℃ 33s，进行40个循环，再95℃ 15s，60℃ 20s，95℃ 15s解离。（4）引物：Cytochrome C：正向引物5-CACTCACCTGCTGCTACTCATTCACGT-3反向引物5-CTCTGTCATACTGGTCACTTCTAC-3;Nestin：正向引物5TTCTCCAAAGTGGGATCTGG-3，反向引物5-CCCCACTTTCTTCCTCATCA-3;内参β-actin：正向引物5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-35-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3。（5）读数：PCR仪自动读取样品阈值（Ct），重复3次，取平均值，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。
1.8 统计学方法 数据采用SPSS 25.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用LSD法进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学评分的比较 与模型组比较，3组在给药前的行为学评分差异无统计学意义（P<0.05），头部+躯体穴位组在0h、24h、48h时均有顯著性差异（P<0.05），躯体穴位组、头部穴位组在24h、48h时均有显著性差异（P<0.05），见表1。
2.2 腓肠肌Nestin mRNA的表达 与模型组比较，3组中Nestin基因表达量均有明显变化，头部+躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24、48h有显著性差异（P<0.05），见图1，见表2。
2.3 腓肠肌Cytochrome C mRNA的表达 与模型组比较，3组中Cytochrome C基因表达量均有明显变化，头针加体针组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见表3。
2.4 前肢肌Nestin mRNA的表达 与模型组比较，3组中Nestin基因表达量均有明显变化，头针加体针组在48h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24h有显著性差异（P<0.05）。见表4。
2.5 前肢肌Cytochrome C mRNA的表达 与模型组比较，3组中Cytochrome C基因表达量均有明显变化，头针加体针组在0、24h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见表5。
2.6 针刺后24h时腓肠肌Nestin 、Cytochrome C蛋白的表达 与模型组比较，3组中Nestin蛋白表达量均有明显变化，头部+躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24、48h有显著性差异（P<0.05）。与模型组比较，3组中Cytochrome C蛋白表达量均有明显变化，头针加体针治疗组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见图1。
2.7 针刺后24h时前肢肌Nestin 、Cytochrome C蛋白的表达 与模型组比较，3组中Nestin蛋白表达量均有明显变化，头针加体针治疗组在48h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24h有显著性差异（P<0.05）。见图2。与模型组比较，3组中Cytochrome C蛋白表达量均有明显变化，头针加体针治疗组在0、24h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见图2。
3 讨论 脑梗死造成偏瘫及失语的发病过程涉及上运动神经元损伤、肌肉失神经支配、废用性萎缩及分解代谢等病理生理变化，研究显示，脑梗死4h后，由于支配运动神经元的突触传递突然中断，运动单位减少，患肢肌肉组织结构开始出现适应性改变，如肌肉质量下降、肌纤维向快收缩纤维转化等[10]，而发病1周左右，健侧肢体也开始出现肌无力现象[11]。目前临床对脑梗死患者偏瘫及失语的康复治疗手段主要包括肢体功能训练、针刺、艾灸、电磁刺激等疗法，其中针刺疗法具有操作简便、成本低廉、副作用小的优势，在改善脑梗死引起的肢体偏瘫及促进肢体神经功能恢复方面发挥着重要疗效，如研究显示，给予脑卒中后偏瘫肢体痉挛患者针刺治疗，能有效缓解患者的痉挛症状，减少神经功能缺损[12];头针联合体针治疗卒中后偏瘫患者，能明显提高患者的总有效率，改善患者病情和生活自理能力[13]。
中医学认为，偏瘫肌群属督脉和膀胱经脉所主，经络所过，主治所及，故选取两经穴位，可达升阳通督、改善骨骼肌肌力的功效，如风府、百会等，又因“治痿独取阳明”，故选“前三里”和“后三里”等穴，共同作为本研究中的穴位。近年来，为了阐明针刺治疗的相关内在机制，针刺基础研究从能量代谢、线粒体活性、细胞离子浓度改变的角度验证了针刺对骨骼肌的作用，也揭示了针刺促进骨骼肌功能恢复的相应机制;研究显示，神经肌肉接头（Neuromuscular junction，NMJ）是运动神经支配骨骼肌的重要功能单位，对有效支配骨骼肌具有重要意义，ACh可通过Nestin来抑制NMJ处ACh受体的簇集，沉默Nestin后细胞膜上的Ach受体表达显著上调[14]，通过电针联合康复训练能通过上调Nestin蛋白表达，促进神经肌肉接头的修复，从而改善骨骼肌的功能[15]。另有研究显示，由线粒体介导的细胞凋亡是脑卒中后神经元凋亡的主要途径，CytC是线粒体内的一种可溶性促凋亡蛋白，生理情况下稳定存在于线粒体中，不能通过细胞外膜进入胞浆，病理状态下，由于线粒体膜功能障碍，CytC可进入细胞质，在ATP/dATP的参与下，促进神经元凋亡，因此可将CytC 作为细胞中线粒体介导的细胞凋亡途径的标志物[16-17]。
然而目前尚未有针刺治疗卒中而对于肢体骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表达的相关研究，本研究结果显示，3组中的大鼠行为学评分均较模型组有不同程度的改善，从Nestin、Cytochrome C蛋白及基因的角度进行研究后发现，针刺对大鼠腓肠肌、前肢肌中Nestin蛋白及基因的表达均有不同程度上调作用，对Cytochrome C蛋白及基因的表达均有不同程度下调作用，如三个针刺组中在0h时腓肠肌中Nestin基因的表达均明显高于模型组，表明针刺在脑梗死早期干预能有效上调骨骼肌中Nestin的表达，进而有利于骨骼肌的功能的修复。在前肢肌中，躯体穴位组在0、24、48h時的Nestin基因表达及24h时的蛋白表达水平均显著高于其他针刺组和模型组，表明在神经肌肉接头的修复及骨骼肌功能恢复方面，针刺躯体穴位具有显著的疗效，并较其他针刺方式更为明显。三个针刺组中在0、24h时，腓肠肌中Cytochrome C基因的表达及24h时的蛋白表达均明显低于模型组，表明针刺在脑梗死早期干预能有效下调骨骼肌中Cytochrome C的表达，进而减少骨骼肌细胞及神经元的凋亡，从而减轻脑梗死引起的偏瘫症状。在前肢肌中，头部穴位组中Cytochrome C基因在0、24h时的表达及在24h时的蛋白表达显著降低，表明早期针刺头部督脉经穴，可有效减少上肢骨骼肌细胞及神经元的凋亡，对降低脑梗死造成的上肢骨骼肌损伤有积极作用。
综上所述，本研究证实了针刺疗法能通过不同程度的上调Nestin蛋白及基因表达，下调Cytochrome C蛋白及基因表达，促进神经肌肉接头功能的修复，减少骨骼肌细胞及神经元的凋亡，改善脑梗死大鼠骨骼肌的功能，表明针刺疗法对急性脑梗死引起的偏瘫、失语等运动功能障碍是一种有效的干预手段。
参考文献：
[1]王娟.缺血性脑卒中临床治疗方法的研究进展[J].现代诊断与治疗，2018，29（16）：2535-2537.
[2]张红利.奥塔戈运动结合早期康复对脑梗死偏瘫患者FMA评分、下肢肌力及MFES评分的影响[J].广东医学，2020，41（5）：491-495.
[3]李璠，梁晓艳，贾文姬，等.依达拉奉对永久性脑缺血大鼠脑内Nestin表达的影响[J].解剖学研究，2019，41（3）：161-166.
[4]郝海珍，郭铁，余丹.脂肪间充质干细胞来源外泌体对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡及炎症因子影响[J].第三军医大学学报，2019，41（17）：1656-1665.
[5]Hoehn B，Yenari MA，Sapolsky RM，et al.Glutathione peroxidase overexpression inhibits cytochrome C release and proapoptotic mediators to protect neurons from experimental stroke[J].Stroke，2003，34（10）：2489-2494.
[6]解光川，侯晓蓉，宋小鸽.针刺对中枢神经损伤保护修复作用的实验研究概况[J].中医药临床杂志，2010，22（12）：1105-1107.
[7]孟宜良.线栓法大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型研究现状[M].国外医学神经病学神经外科学分册，2002，2（29）：113-115.
[8]Bederson JB，Pitts LH，Germano SM，et al.Evaluation of 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats[J].Stroke，1986，17（6）：1304-1308. [9]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17（3）：472-476.
[10]Lathuilière A，Mareschal J，Graf CE.How to Prevent Loss of Muscle Mass and Strength among Older People in Neuro-Rehabilitation[J].Nutrients，2019，11（4）：881.
[11]Arasaki K，Igarashi O，Machida T，et al.Reduction in the motor unit number estimate（MUNE）after cerebral infarction[J].Suppl Clin Neurophysiol，2009，60：189-195.
[12]劉海.针刺对脑卒中后偏瘫肢体痉挛患者神经功能缺损的影响[J].现代诊断与治疗，2019，30（20）：3533-3535.
[13]闫素洁，周时伟，宋洋洋.头针联合体针治疗脑卒中后偏瘫84例临床观察[J].湖南中医杂志，2019，35（8）：69-70.
[14]Yang J，Dominguez B，de Winter F，et al.Nestin negatively regulates postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse[J].Nat Neurosci，2011，14（3）：324-330.
[15]于杨，郭文海，高艺书，等.电针联合康复训练对急性骨骼肌损伤大鼠nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白表达的影响[J].针灸临床杂志，2020，36（1）：62-65.
[16]Martinou JC，Youle RJ.Mitochondria in apoptosis：Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J].Dev Cell，2011，21（1）：92-101.
[17]Huang XP，Tan H，Chen BY，Deng CQ.Astragalus extract alleviates nerve injury after cerebral ischemia by improving energy metabolism and inhibiting apoptosis[J].Biol Pharm Bull，2012，35（4）：449-454.
（收稿日期：2021-07-27）
关键词：Nestin;细胞色素C;脑梗死;骨骼肌;针刺
中图分类号：R246 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2021）11-0071-05
脑梗死是由脑组织局部血液供应障碍，引起缺血、缺氧进而病变坏死的疾病，为临床常见病、多发病，具有起病急、进展快的特点，已成为威胁我国中老年人群身体健康和生命的主要疾病[1]。研究显示，脑梗死可引起不同程度的上运动神经元损害，60%以上的患者会出现偏瘫、失语等后遗症，严重影响患者的生存质量[2]，而肌群功能减弱及废用性萎缩是造成偏瘫、失语发生的主要原因，因此，探索有效的防治方法已成为目前脑梗死患者康复亟需解决的关键问题。巢蛋白（Nestin）是一种神经肌肉接头相关蛋白，研究显示，在缺血性损伤神经修复过程中，Nestin阳性细胞增加，并分化为神经元和神经胶质细胞，从而有利于神经系统结构及功能恢复[3]。细胞色素C是线粒体中一种可溶性促凋亡蛋白，在组织缺血时，释放到胞浆后激活线粒体凋亡程序，是多种细胞凋亡的共同途径，研究显示，抑制细胞色素C的表达可对缺血性损伤后神经元凋亡发挥抑制作用[4-5];针刺疗法在治疗脑梗死后遗症方面有着显著疗效，然而既往针刺相关的基础研究多侧重于神经可塑性及恢复神经细胞功能方面[6]，而忽略了对骨骼肌细胞增殖及凋亡及功能研究，尤其对针刺干预的具体机制阐述不足;本研究通过观察针刺对脑梗死大鼠骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表达水平的影响，旨在揭示针刺在恢复肌肉功能及神经修复中的作用机制，为临床应用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 动物与分组 SPF级健康雄性SD大鼠，体重240g，共100只，由浙江省实验动物中心提供，许可证号：SYXK（浙）2014-0008。实验前在实验中心适应性喂养1周，环境条件通風、隔音、自然光照，温度18～26℃、相对湿度50%～60%，自由饮食。对实验动物的各项处理均严格按照2006版《关于善待实验动物的指导性意见》中规定执行。
1.2 主要仪器与试剂 水浴锅（XMTD-6000，上海宜昌仪器纱筛厂）;低温离心机（湘仪实验仪器厂）;实时荧光定量（realtime-PCR）仪（美国ThermoFisher仪器有限公司）;漩涡振荡仪（XH-C，金坛市医疗仪器厂）;针灸针（0.25 mm×13 mm，天和医治器械有限公司）。Anti-Nestin抗体（Thermo Fisher Scientific）、Anti-Cytochrome C抗体（Thermo Fisher Scientific）、BCA蛋白浓度检测试剂盒（北京碧云天公司）、Trizol柱纯化总RNA试剂盒（simgen）;Fast 1st strand cDNA Synthesis Kit（with gDNase）（simgen）、2×SYBR Green PCR Mix（simgen）、50×ROX Reference Dye（simgen）。
1.3 模型制备 脑梗死模型大鼠采用孟宜良的线拴法标准步骤进行制备，在成功结扎颈外动脉远心端和颈总动脉近心端后，大脑中动脉局灶性脑缺血模型即成功[7]，大鼠在自然苏醒后，依照Zea-Longa的5级评分标准评估神经障碍情况[8]，筛选合格模型用于下一步实验。
1.4 动物分组 选取未造模大鼠作为空白对照组，将造模成功的模型大鼠随机分为模型组、头部穴位组、躯体穴位组、头部+躯体穴位组，每组15只。再将各组中模型大鼠2次分组，分为3个亚组用于不同时间点的检测（0、24、48h），每组5只。均给予正常饮食喂养。
1.5 针刺方法 取穴和针刺手法参照华兴邦等研制的《大鼠穴位图谱》，在动物清醒状态下，选用动物一侧“百会”、“风府”、“大椎”、“前三里”、“后三里”等穴，给予针刺捻转1 min，频率（80±5）次/min，平补平泻：“百会”后斜刺2 mm，“风府”下斜刺2 mm，“后三里”直刺7 mm，“前三里”直刺5 mm，“环跳”直刺7 mm，“后会”斜刺2 mm，“阳陵泉”直刺5 mm。针刺1次，留针30 min。所有针刺操作由同一人进行。空白组与模型组不予针刺。 1.6 行为学评分 在针刺治疗后0、24、48h时参照Bederson等[9]改良方法对大鼠行为学变化进行评估。分值为0～4分，0分：未见行为缺陷;1分：前肢屈曲，不能完全伸展;2分：前肢屈曲伴侧推抵抗力下降，无转圈行;3分：前肢屈曲伴侧推抵抗力下降，伴有自发性旋转;4分：意识障碍，不能自主行走。
1.7 标准取材及检测 针刺干预完成后，在对应时间点采用脊椎脱臼法快速处死大鼠，分离前肢肌、腓肠肌针刺局部的骨骼肌，装于冻存管置于液氮中备测。采用Western Blotting法检测针刺治疗后24h时前肢肌、腓肠肌组织中Nestin、Cytochrome C蛋白的表达：按蛋白提取试剂盒说明提取Nestin、Cytochrome C和β-actin的总蛋白，根据BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定。分别加入一抗4℃孵育过夜，TBST洗涤，二抗孵育1 h，TBST洗涤，再加入ECL化学发光试剂进行显影。采用qRT-PCR法检测组织中Nestin、Cytochrome C基因的表达：（1）RNA提取：取肌组织称重后加入裂解液，充分研磨匀浆后，用严格按照Trizol试剂盒提取RNA，具体步骤参照说明书。（2）逆转录合成cDNA：取2 μg上述提取的RNA用于逆转录，稀释10倍后分装备用。（3）PCR扩增：按照实时荧光定量试剂盒操作步骤，上机进行扩增实验，扩增条件为如下：95℃ 1 min，预变性;95℃ 5s，60℃ 33s，进行40个循环，再95℃ 15s，60℃ 20s，95℃ 15s解离。（4）引物：Cytochrome C：正向引物5-CACTCACCTGCTGCTACTCATTCACGT-3反向引物5-CTCTGTCATACTGGTCACTTCTAC-3;Nestin：正向引物5TTCTCCAAAGTGGGATCTGG-3，反向引物5-CCCCACTTTCTTCCTCATCA-3;内参β-actin：正向引物5-CCCATCTATGAGGGTTACGC-35-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3。（5）读数：PCR仪自动读取样品阈值（Ct），重复3次，取平均值，采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA的相对表达量。
1.8 统计学方法 数据采用SPSS 25.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），进一步两两比较采用LSD法进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 行为学评分的比较 与模型组比较，3组在给药前的行为学评分差异无统计学意义（P<0.05），头部+躯体穴位组在0h、24h、48h时均有顯著性差异（P<0.05），躯体穴位组、头部穴位组在24h、48h时均有显著性差异（P<0.05），见表1。
2.2 腓肠肌Nestin mRNA的表达 与模型组比较，3组中Nestin基因表达量均有明显变化，头部+躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24、48h有显著性差异（P<0.05），见图1，见表2。
2.3 腓肠肌Cytochrome C mRNA的表达 与模型组比较，3组中Cytochrome C基因表达量均有明显变化，头针加体针组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见表3。
2.4 前肢肌Nestin mRNA的表达 与模型组比较，3组中Nestin基因表达量均有明显变化，头针加体针组在48h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24h有显著性差异（P<0.05）。见表4。
2.5 前肢肌Cytochrome C mRNA的表达 与模型组比较，3组中Cytochrome C基因表达量均有明显变化，头针加体针组在0、24h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见表5。
2.6 针刺后24h时腓肠肌Nestin 、Cytochrome C蛋白的表达 与模型组比较，3组中Nestin蛋白表达量均有明显变化，头部+躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24、48h有显著性差异（P<0.05）。与模型组比较，3组中Cytochrome C蛋白表达量均有明显变化，头针加体针治疗组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见图1。
2.7 针刺后24h时前肢肌Nestin 、Cytochrome C蛋白的表达 与模型组比较，3组中Nestin蛋白表达量均有明显变化，头针加体针治疗组在48h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在24h有显著性差异（P<0.05）。见图2。与模型组比较，3组中Cytochrome C蛋白表达量均有明显变化，头针加体针治疗组在0、24h有显著性差异（P<0.05），躯体穴位组在0、24、48h均有显著性差异（P<0.05），头部穴位组在0、24h有显著性差异（P<0.05）。见图2。
3 讨论 脑梗死造成偏瘫及失语的发病过程涉及上运动神经元损伤、肌肉失神经支配、废用性萎缩及分解代谢等病理生理变化，研究显示，脑梗死4h后，由于支配运动神经元的突触传递突然中断，运动单位减少，患肢肌肉组织结构开始出现适应性改变，如肌肉质量下降、肌纤维向快收缩纤维转化等[10]，而发病1周左右，健侧肢体也开始出现肌无力现象[11]。目前临床对脑梗死患者偏瘫及失语的康复治疗手段主要包括肢体功能训练、针刺、艾灸、电磁刺激等疗法，其中针刺疗法具有操作简便、成本低廉、副作用小的优势，在改善脑梗死引起的肢体偏瘫及促进肢体神经功能恢复方面发挥着重要疗效，如研究显示，给予脑卒中后偏瘫肢体痉挛患者针刺治疗，能有效缓解患者的痉挛症状，减少神经功能缺损[12];头针联合体针治疗卒中后偏瘫患者，能明显提高患者的总有效率，改善患者病情和生活自理能力[13]。
中医学认为，偏瘫肌群属督脉和膀胱经脉所主，经络所过，主治所及，故选取两经穴位，可达升阳通督、改善骨骼肌肌力的功效，如风府、百会等，又因“治痿独取阳明”，故选“前三里”和“后三里”等穴，共同作为本研究中的穴位。近年来，为了阐明针刺治疗的相关内在机制，针刺基础研究从能量代谢、线粒体活性、细胞离子浓度改变的角度验证了针刺对骨骼肌的作用，也揭示了针刺促进骨骼肌功能恢复的相应机制;研究显示，神经肌肉接头（Neuromuscular junction，NMJ）是运动神经支配骨骼肌的重要功能单位，对有效支配骨骼肌具有重要意义，ACh可通过Nestin来抑制NMJ处ACh受体的簇集，沉默Nestin后细胞膜上的Ach受体表达显著上调[14]，通过电针联合康复训练能通过上调Nestin蛋白表达，促进神经肌肉接头的修复，从而改善骨骼肌的功能[15]。另有研究显示，由线粒体介导的细胞凋亡是脑卒中后神经元凋亡的主要途径，CytC是线粒体内的一种可溶性促凋亡蛋白，生理情况下稳定存在于线粒体中，不能通过细胞外膜进入胞浆，病理状态下，由于线粒体膜功能障碍，CytC可进入细胞质，在ATP/dATP的参与下，促进神经元凋亡，因此可将CytC 作为细胞中线粒体介导的细胞凋亡途径的标志物[16-17]。
然而目前尚未有针刺治疗卒中而对于肢体骨骼肌Nestin、Cytochrome C蛋白及基因表达的相关研究，本研究结果显示，3组中的大鼠行为学评分均较模型组有不同程度的改善，从Nestin、Cytochrome C蛋白及基因的角度进行研究后发现，针刺对大鼠腓肠肌、前肢肌中Nestin蛋白及基因的表达均有不同程度上调作用，对Cytochrome C蛋白及基因的表达均有不同程度下调作用，如三个针刺组中在0h时腓肠肌中Nestin基因的表达均明显高于模型组，表明针刺在脑梗死早期干预能有效上调骨骼肌中Nestin的表达，进而有利于骨骼肌的功能的修复。在前肢肌中，躯体穴位组在0、24、48h時的Nestin基因表达及24h时的蛋白表达水平均显著高于其他针刺组和模型组，表明在神经肌肉接头的修复及骨骼肌功能恢复方面，针刺躯体穴位具有显著的疗效，并较其他针刺方式更为明显。三个针刺组中在0、24h时，腓肠肌中Cytochrome C基因的表达及24h时的蛋白表达均明显低于模型组，表明针刺在脑梗死早期干预能有效下调骨骼肌中Cytochrome C的表达，进而减少骨骼肌细胞及神经元的凋亡，从而减轻脑梗死引起的偏瘫症状。在前肢肌中，头部穴位组中Cytochrome C基因在0、24h时的表达及在24h时的蛋白表达显著降低，表明早期针刺头部督脉经穴，可有效减少上肢骨骼肌细胞及神经元的凋亡，对降低脑梗死造成的上肢骨骼肌损伤有积极作用。
综上所述，本研究证实了针刺疗法能通过不同程度的上调Nestin蛋白及基因表达，下调Cytochrome C蛋白及基因表达，促进神经肌肉接头功能的修复，减少骨骼肌细胞及神经元的凋亡，改善脑梗死大鼠骨骼肌的功能，表明针刺疗法对急性脑梗死引起的偏瘫、失语等运动功能障碍是一种有效的干预手段。
参考文献：
[1]王娟.缺血性脑卒中临床治疗方法的研究进展[J].现代诊断与治疗，2018，29（16）：2535-2537.
[2]张红利.奥塔戈运动结合早期康复对脑梗死偏瘫患者FMA评分、下肢肌力及MFES评分的影响[J].广东医学，2020，41（5）：491-495.
[3]李璠，梁晓艳，贾文姬，等.依达拉奉对永久性脑缺血大鼠脑内Nestin表达的影响[J].解剖学研究，2019，41（3）：161-166.
[4]郝海珍，郭铁，余丹.脂肪间充质干细胞来源外泌体对脑缺血再灌注大鼠神经元凋亡及炎症因子影响[J].第三军医大学学报，2019，41（17）：1656-1665.
[5]Hoehn B，Yenari MA，Sapolsky RM，et al.Glutathione peroxidase overexpression inhibits cytochrome C release and proapoptotic mediators to protect neurons from experimental stroke[J].Stroke，2003，34（10）：2489-2494.
[6]解光川，侯晓蓉，宋小鸽.针刺对中枢神经损伤保护修复作用的实验研究概况[J].中医药临床杂志，2010，22（12）：1105-1107.
[7]孟宜良.线栓法大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血模型研究现状[M].国外医学神经病学神经外科学分册，2002，2（29）：113-115.
[8]Bederson JB，Pitts LH，Germano SM，et al.Evaluation of 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride as a stain for detection and quantification of experimental cerebral infarction in rats[J].Stroke，1986，17（6）：1304-1308. [9]Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke，1986，17（3）：472-476.
[10]Lathuilière A，Mareschal J，Graf CE.How to Prevent Loss of Muscle Mass and Strength among Older People in Neuro-Rehabilitation[J].Nutrients，2019，11（4）：881.
[11]Arasaki K，Igarashi O，Machida T，et al.Reduction in the motor unit number estimate（MUNE）after cerebral infarction[J].Suppl Clin Neurophysiol，2009，60：189-195.
[12]劉海.针刺对脑卒中后偏瘫肢体痉挛患者神经功能缺损的影响[J].现代诊断与治疗，2019，30（20）：3533-3535.
[13]闫素洁，周时伟，宋洋洋.头针联合体针治疗脑卒中后偏瘫84例临床观察[J].湖南中医杂志，2019，35（8）：69-70.
[14]Yang J，Dominguez B，de Winter F，et al.Nestin negatively regulates postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse[J].Nat Neurosci，2011，14（3）：324-330.
[15]于杨，郭文海，高艺书，等.电针联合康复训练对急性骨骼肌损伤大鼠nestin、Cdk5和ε-nAChR蛋白表达的影响[J].针灸临床杂志，2020，36（1）：62-65.
[16]Martinou JC，Youle RJ.Mitochondria in apoptosis：Bcl-2 family members and mitochondrial dynamics[J].Dev Cell，2011，21（1）：92-101.
[17]Huang XP，Tan H，Chen BY，Deng CQ.Astragalus extract alleviates nerve injury after cerebral ischemia by improving energy metabolism and inhibiting apoptosis[J].Biol Pharm Bull，2012，35（4）：449-454.
（收稿日期：2021-07-27）