【摘 要】
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【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）和3型（PCV-3）、非洲猪瘟病毒（ASFV）以及猪博卡病毒1型（PBoV-G1）、2型（PBoV-G2）和3型（PBoV-G3）等呼吸道病毒的核酸质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-T
【基金项目】
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国家重点研发计划（2021YFF0602800）； 浙江省重点研发计划（2021C02060）；
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【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV-2）和3型（PCV-3）、非洲猪瘟病毒（ASFV）以及猪博卡病毒1型（PBoV-G1）、2型（PBoV-G2）和3型（PBoV-G3）等呼吸道病毒的核酸质谱（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）高通量多目标检测技术。【方法】根据7种病原体基因的保守序列，分别设计不同病原的引物及对应单碱基延伸探针，通过引物浓度和反应条件优化，方法特异性、敏感性和稳定性分析，以及临床样本和猪源产制品的检测验证，建立了常见猪呼吸道DNA病毒的MALDI-TOF MS多目标检测体系。【结果】质谱分析显示，多目标检测体系的7种靶标产物峰只在特定病毒阳性样品检测时产生，与其他病原体检测无交叉反应，表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示，体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性符合率均≥98.0%，批间均≥98.3%，表明该方法具有较高的稳定性。体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65–26.27拷贝/μL之间，与荧光PCR检测方法相当。采用MALDI-TOF MS多重检测方法对100份组织、饲料和猪肉样品进行检测应用，检出两种及以上混合感染样品39份，其中5份样本同步检出5种病原体阳性；对8份ASFV-p72假病毒人工污染样品进行验证，均可检出ASFV阳性。将以上样本检测应用结果与荧光PCR方法分析结果进行比对验证，两种方法对于不同病原体检测结果的符合率高达94.4%–100%。【结论】本研究建立的基于MALDI-TOF MS的猪呼吸道常见DNA病毒多重检测方法为猪群相关疫病快速监测和鉴别诊断，以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。
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