探讨H2O2对人皮肤成纤维细胞(NHSF)衰老标记蛋白30(SMP30)以及细胞自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(LC3Ⅱ)的影响。
方法用150 μmol/L H2O2处理2~4代NHSF 2 h,构建细胞衰老模型作为H2O2组,而未处理的NHSF作为对照组。细胞衰老β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色法检测衰老细胞比例,间接免疫荧光检测自噬相关蛋白LC3的表达,反转录PCR(RT-PCR)检测SMP30 mRNA的表达,Western印迹法检测SMP30和LC3蛋白的表达。
结果H2O2组NHSF的SA-β-gal染色阳性率(41.70% ± 2.95%)显著高于对照组(3.03% ± 0.25%,t = 22.59,P < 0.05)。间接免疫荧光结果显示,H2O2组NHSF LC3阳性率(12.60% ± 1.57%)明显低于对照组(23.67% ± 3.04%,t = 5.61,P < 0.05)。Western印迹显示,H2O2组LC3Ⅰ/GAPDH比值(0.40 ± 0.02)与对照组(0.41 ± 0.04)比较差异无统计学意义(P > 0.05),而H2O2组LC3Ⅱ/GAPDH比值(0.20 ± 0.02)明显低于对照组(0.80 ± 0.03,t = 29.69,P < 0.05),且H2O2组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(0.51 ± 0.03)亦明显低于对照组(1.98 ± 0.23,t = 10.967,P < 0.05)。H2O2组SMP30 mRNA和蛋白水平(与GAPDH mRNA和蛋白的比值分别为0.16 ± 0.01和0.27 ± 0.02)明显低于对照组(分别为0.35 ± 0.01和0.63 ± 0.02),均P < 0.05。
结论H2O2可降低NHSF中SMP30及LC3Ⅱ的表达水平,加速NHSF衰老。