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摘要 [目的] 研究通过愈伤组织途径诱导形成朱顶红原球茎。[方法]以朱顶红（Hippeastrum vittatum）鳞茎作为外植体，通过愈伤组织途径诱导形成原球茎，并建立再生植株。[结果]诱导愈伤组织最佳培养基为MS+
6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，诱导率达到80%；诱导原球茎增殖的培养基为MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导原球茎系数达到15～20个；诱导原球茎生长最佳培养基为1/2MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO4 80 mg/L+TIBA 0.5 mg/L；诱导原球茎生根培养基为1/2MS+IBA0.5 mg/L，生根率可达100%。[结论] 建立了朱顶红再生植株，实现了朱顶红快速繁殖目标，为朱顶红的种苗生产提供技术支撑。
关键词 朱顶红；愈伤组织；原球茎；再生植株
中图分类号 S682.2+5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-051-04
Abstract [Objective] The aim was to study the development of Hippeastrum vittatum by callus induced using bulbs as explants. [Method]Callus were induced using bulbs as explants then the protocorm was developed and regeneration plants were established. [Result]The results showed that the optimal medium for callus induction was MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L， the callus induction rate of bulbs was the highest， the induction rate reached 80%； medium to induce proliferation of protocorm like bodies was MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L， inducing protocorm coefficient could reach 15-20； the optimal medium of protocorm growth was 1/2 MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ KH2PO4 80 mg/L+TIBA 0.5 mg/L；Induction of protocorm rooting medium was 1/2 MS+IBA 0.5mg/L，the rooting rate was up to 100%. [Conclusion] Regeneration plant of Hippeastrum vittatum was established， and realize the fast breeding goal， in order to provide technical support for seedlings production.
Key words Hippeastrum vittatum；Callus；Protocorm；Regenerated plant
朱顶红（Hippeastrum vittatum）属于石蒜科孤挺花属多年生草本植物[1-2]，又名孤挺花、百支莲和喇叭花。常见的栽培品种有红狮子（Red lion）、橙色塞维（Orange Souvereign）、苹果（Apple Blossom）、蒙特布朗（Mount Blanc）等[3]。朱顶红原产巴西和南非，喜温暖湿润和阳光充足的环境[4]。属于球根花卉，地下部分具有鳞茎（Bulbs），鳞茎是变态的茎，有短缩而扁盘状的鳞茎盘，肥厚多肉的鳞叶就着生在鳞茎盘上鳞茎中贮藏丰富的有机物和水分，有利于渡过不利的气候条件。由于朱顶红花色艳丽等原因越来越受到国内外广大消费者的喜爱，被广泛应用于盆栽、切花和园林绿化中。朱顶红还具有解毒消肿、抑制真菌[5]等药用价值，亦可提取天然食用色素[6]。但朱顶红栽培品种自花不实，通常采用无性分球法繁殖，繁殖系数小，且品种极易退化，要解决好这一问题，离体快繁研究的加速发展，具有重要的现实意义，也是进行工厂化育苗的一条有效途径。目前，朱顶红组织培养技术研究虽然取得了長足发展，但仍存在繁殖率低、繁殖周期长等问题，限制了朱顶红组织培养技术的推广应用，笔者在前人研究朱顶红组织培养技术的基础上，通过诱导朱顶红鳞茎形成愈伤组织，进而形成原球茎，并建立再生植株，实现朱顶红快速繁殖目标，为朱顶红种苗生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 基本培养基的筛选
选择生长良好、无病虫害的朱顶红为试验材料，于2012～2013年在内蒙古农业大学林学院组织培养实验室进行研究。选取直径5～8 cm的鳞茎，用自来水冲净表层，去除须根、叶和最外一层的鳞茎片。常规消毒后将鳞茎切成0.5～1.0 cm3大小的方块，接种于不同浓度的NAA及6BA MS培养基中，从而筛选出最适的基本培养基。
1.2 愈伤组织的诱导
采用朱顶红鳞茎为外植体设计2种初代愈伤组织诱导培养基：①MS+NAA 1.0 mg/L+ 6BA 2.0 mg/L；②MS+NAA 1.0 mg/L+ 6BA 1.5 mg/L。将常规消毒后的鳞茎切块分别接种到不同诱导培养基中，每个三角瓶中随机接种 4 块，18个重复，在（25±1）℃下暗培养30 d，统计愈伤组织诱导率。
1.3 原球茎的诱导及增殖 将3～4代愈伤组织转接到以下培养基：①MS+NAA 0.1 mg/L+ 6BA 1.0 mg/L；②MS+NAA 0.1 mg/L+ 6BA 1.5 mg/L；③MS+NAA 0.1 mg/L+ 6BA 2.0 mg/L诱导原球茎的发生。每瓶培养基接种3～4块愈伤组织，每种培养基18个重复，光照时间12 h/d，30 d后统计原球茎的发生率。
1.4 诱导原球茎生长
以原球茎诱导培养和增殖培养直径未能达到1 cm的未感染原球茎作为外植体，接种在附加KH2PO4 80 mg/L、TIBA 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L和不同浓度6BA的1/2MS培养基中，培养30 d后观察原球茎生长情况。
1.5 生根及移栽
将增殖直径0.5～0.8 cm的小鳞茎分别接种于附加NAA 0.1 mg/L和不同浓度6BA的1/2MS培养基中，30 d后观察原球茎生根状况。当苗高达到3～ 4 cm、根长2～3 cm时进行驯化。
2 结果与分析
2.1 外植体消毒时间对朱顶红诱导愈伤组织的影响
朱顶红大球常年生于地下，极易感染红斑病，带菌较严重，因此选用2%NaClO试剂对外植体进行处理，应用MS培养基进行培养，观测其污染率和愈伤组织诱导和增殖情况。从表1可以看出，消毒时间直接影响愈伤组织的增殖。以污染率低和愈伤组织诱导和增殖状况正常作为确定消毒时间的标准，结果表明，鳞茎浸泡8.0 min为最佳消毒时间，其污染率为12.0%，愈伤组织增殖正常。
2.2 6BA对朱顶红愈伤组织诱导的影响
从表2和图1可以看出，诱导愈伤组织最佳培养基为MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，诱导率达到80%。
2.3 6BA对朱顶红原球茎发生和增殖的影响
将愈伤组织接种到诱导原球茎发生和增殖培养基中进行培养，结果表明，6BA 1.5 mg/L对诱导原球茎有明显的作用。MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的组合可诱导形成15～20个原球茎，诱导原球茎系数最大（表3、图2）。
2.4 6BA对朱顶红原球茎生长的影响
以原球茎诱导培养和增殖培养直径未能达到1 cm的未感染原球茎作为外植体，培养在附加KH2PO4 80 mg/L、TIBA 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L和不同浓度6BA的1/2MS培养基中，从表4可以看出，当NAA浓度不变时，随着6BA浓度的增加原球茎直径有增大趋势，当6BA浓度达到一定值时，原球茎的直径出现下降趋势，培养原球茎生长的最佳培养基为1/2MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO4 80 mg/L+TIBA0.5 mg/L，原球茎直径可达3 cm（图3）。
2.5 原球茎诱导生根
将直径3 cm左右未感染的原球茎作为外植体，置于1/2MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 mg/L+琼脂6 mg/L诱导原球茎生根培养基上，结果表明培养25 d生根率可达100%（图4）。
2.6 朱顶红试管苗的驯化和移栽
朱顶红为球根花卉，在驯化和移栽时，容易成活。在驯化过程中，适当增加自然光照时间可以提高移栽成活率。当根数达到2～4条、根长2～4 cm时，可以驯化移栽。先揭开三角瓶瓶口，在培养室内放置1 d，然后用镊子取出植株，洗掉根部附着的培养基，栽于蛭石∶腐殖土∶珍珠岩=1∶1∶1的基质上，保持基质湿润， 10 d后小植株成活，成活率可达95%以上（图5）。
3 结论与讨论
诱导形成原球茎是朱顶红组织培养快繁技术的关键问题，如何快速诱导愈伤组织和原球茎、增加愈伤组织和原球茎增殖数量成为解决关键问题的重要内容。张松等[7]、张亚玲等[8]对朱頂红组织培养快繁途径研究指出，不同激素配比的MS培养基，先诱导形成愈伤组织，再形成不定芽或胚状体，能提高不定芽诱导率。高年春等[9]认为诱导朱顶红不定芽1/2MS培养基比MS好，并指出在培养基中添加活性炭可以提高不定芽诱导率。这些研究者从不同角度研究了提高不定芽或胚状体诱导率技术。在植物组织培养中，再生植物形态发生的过程一般划分为愈伤组织形成和器官发生2个阶段，这2个阶段因不同的植物取材部位不同，其培养效果有显著差异[10-11]。同一植物取自不同器官、组织的外植体，其形态发生也有很大差异。该研究认为影响朱顶红愈伤组织和原球茎诱导率主要因素是激素组合，通过研究不同的激素组合，筛选出能快速诱导愈伤组织和原球茎、提高愈伤组织和原球茎增殖数量的最佳培养基。该研究表明，MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L培养基能快速从鳞茎诱导出愈伤组织，诱导率也较高（80%）；以MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L为培养基诱导原球茎增殖数量最佳；原球茎生长培养的最佳培养基为 1/2MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO4 80 mg/L+TIBA 0.5 mg/L。
参考文献
[1]韦三立.花卉组织培养[M].北京：中国林业出版社，2001
[2] 姜明兰，钟文田.朱顶红愈伤组织的诱导和植株再生[J].植物生理学通讯，1984（1）：37-38.
[3] 张松，达克东，曹辰兴，等.朱顶红离体培养快速繁殖体系及杯壮体发生[J].园艺报，2002，29（3）：285-287.
[4] 王红芳，贾春兰.园艺植物组培苗工厂化生产（三）—优良品种的快速繁殖[J].农村实用工程技术，1996（1）：2.
[5] 鲁红学，彭跃峰，熊定志. 朱顶红鳞茎提取物的抑菌作用研[J].安徽农业科学，2006（9）：19061907.
[6] 蒋新龙，蒋益花.朱顶红花红色素的提取条件及理化性质[J].浙江农业学报，2006，18（2）：113-117.
[7] 张松，达克东，曹辰兴.朱顶红离体培养快速繁殖体系及胚状体发生[J].园艺学报，2002（3）：285-287.
[8] 张亚玲，张延龙，原雅玲.6BA和NAA对朱顶红组织培养的影响[J].陕西林业科技，2006（1）：7-9.
[9] 高年春，杨 怡，曹荣祥.几个杂交朱顶红品种不定芽诱导试验[J].江苏农业科学，2003（6）：80-82.
[10] 曹孜义. 实用组织培养技术教程[M].兰州： 甘肃科技出版社，2001.
[11] 王爱勤，周歧伟，何龙飞，等. 百合试管结鳞茎的研究[J].广西农业大学学报，1998， 17（1）：71-75.
6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，诱导率达到80%；诱导原球茎增殖的培养基为MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，诱导原球茎系数达到15～20个；诱导原球茎生长最佳培养基为1/2MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO4 80 mg/L+TIBA 0.5 mg/L；诱导原球茎生根培养基为1/2MS+IBA0.5 mg/L，生根率可达100%。[结论] 建立了朱顶红再生植株，实现了朱顶红快速繁殖目标，为朱顶红的种苗生产提供技术支撑。
关键词 朱顶红；愈伤组织；原球茎；再生植株
中图分类号 S682.2+5 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）13-051-04
Abstract [Objective] The aim was to study the development of Hippeastrum vittatum by callus induced using bulbs as explants. [Method]Callus were induced using bulbs as explants then the protocorm was developed and regeneration plants were established. [Result]The results showed that the optimal medium for callus induction was MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L， the callus induction rate of bulbs was the highest， the induction rate reached 80%； medium to induce proliferation of protocorm like bodies was MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L， inducing protocorm coefficient could reach 15-20； the optimal medium of protocorm growth was 1/2 MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+ KH2PO4 80 mg/L+TIBA 0.5 mg/L；Induction of protocorm rooting medium was 1/2 MS+IBA 0.5mg/L，the rooting rate was up to 100%. [Conclusion] Regeneration plant of Hippeastrum vittatum was established， and realize the fast breeding goal， in order to provide technical support for seedlings production.
Key words Hippeastrum vittatum；Callus；Protocorm；Regenerated plant
朱顶红（Hippeastrum vittatum）属于石蒜科孤挺花属多年生草本植物[1-2]，又名孤挺花、百支莲和喇叭花。常见的栽培品种有红狮子（Red lion）、橙色塞维（Orange Souvereign）、苹果（Apple Blossom）、蒙特布朗（Mount Blanc）等[3]。朱顶红原产巴西和南非，喜温暖湿润和阳光充足的环境[4]。属于球根花卉，地下部分具有鳞茎（Bulbs），鳞茎是变态的茎，有短缩而扁盘状的鳞茎盘，肥厚多肉的鳞叶就着生在鳞茎盘上鳞茎中贮藏丰富的有机物和水分，有利于渡过不利的气候条件。由于朱顶红花色艳丽等原因越来越受到国内外广大消费者的喜爱，被广泛应用于盆栽、切花和园林绿化中。朱顶红还具有解毒消肿、抑制真菌[5]等药用价值，亦可提取天然食用色素[6]。但朱顶红栽培品种自花不实，通常采用无性分球法繁殖，繁殖系数小，且品种极易退化，要解决好这一问题，离体快繁研究的加速发展，具有重要的现实意义，也是进行工厂化育苗的一条有效途径。目前，朱顶红组织培养技术研究虽然取得了長足发展，但仍存在繁殖率低、繁殖周期长等问题，限制了朱顶红组织培养技术的推广应用，笔者在前人研究朱顶红组织培养技术的基础上，通过诱导朱顶红鳞茎形成愈伤组织，进而形成原球茎，并建立再生植株，实现朱顶红快速繁殖目标，为朱顶红种苗生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 基本培养基的筛选
选择生长良好、无病虫害的朱顶红为试验材料，于2012～2013年在内蒙古农业大学林学院组织培养实验室进行研究。选取直径5～8 cm的鳞茎，用自来水冲净表层，去除须根、叶和最外一层的鳞茎片。常规消毒后将鳞茎切成0.5～1.0 cm3大小的方块，接种于不同浓度的NAA及6BA MS培养基中，从而筛选出最适的基本培养基。
1.2 愈伤组织的诱导
采用朱顶红鳞茎为外植体设计2种初代愈伤组织诱导培养基：①MS+NAA 1.0 mg/L+ 6BA 2.0 mg/L；②MS+NAA 1.0 mg/L+ 6BA 1.5 mg/L。将常规消毒后的鳞茎切块分别接种到不同诱导培养基中，每个三角瓶中随机接种 4 块，18个重复，在（25±1）℃下暗培养30 d，统计愈伤组织诱导率。
1.3 原球茎的诱导及增殖 将3～4代愈伤组织转接到以下培养基：①MS+NAA 0.1 mg/L+ 6BA 1.0 mg/L；②MS+NAA 0.1 mg/L+ 6BA 1.5 mg/L；③MS+NAA 0.1 mg/L+ 6BA 2.0 mg/L诱导原球茎的发生。每瓶培养基接种3～4块愈伤组织，每种培养基18个重复，光照时间12 h/d，30 d后统计原球茎的发生率。
1.4 诱导原球茎生长
以原球茎诱导培养和增殖培养直径未能达到1 cm的未感染原球茎作为外植体，接种在附加KH2PO4 80 mg/L、TIBA 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L和不同浓度6BA的1/2MS培养基中，培养30 d后观察原球茎生长情况。
1.5 生根及移栽
将增殖直径0.5～0.8 cm的小鳞茎分别接种于附加NAA 0.1 mg/L和不同浓度6BA的1/2MS培养基中，30 d后观察原球茎生根状况。当苗高达到3～ 4 cm、根长2～3 cm时进行驯化。
2 结果与分析
2.1 外植体消毒时间对朱顶红诱导愈伤组织的影响
朱顶红大球常年生于地下，极易感染红斑病，带菌较严重，因此选用2%NaClO试剂对外植体进行处理，应用MS培养基进行培养，观测其污染率和愈伤组织诱导和增殖情况。从表1可以看出，消毒时间直接影响愈伤组织的增殖。以污染率低和愈伤组织诱导和增殖状况正常作为确定消毒时间的标准，结果表明，鳞茎浸泡8.0 min为最佳消毒时间，其污染率为12.0%，愈伤组织增殖正常。
2.2 6BA对朱顶红愈伤组织诱导的影响
从表2和图1可以看出，诱导愈伤组织最佳培养基为MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，诱导率达到80%。
2.3 6BA对朱顶红原球茎发生和增殖的影响
将愈伤组织接种到诱导原球茎发生和增殖培养基中进行培养，结果表明，6BA 1.5 mg/L对诱导原球茎有明显的作用。MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的组合可诱导形成15～20个原球茎，诱导原球茎系数最大（表3、图2）。
2.4 6BA对朱顶红原球茎生长的影响
以原球茎诱导培养和增殖培养直径未能达到1 cm的未感染原球茎作为外植体，培养在附加KH2PO4 80 mg/L、TIBA 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L和不同浓度6BA的1/2MS培养基中，从表4可以看出，当NAA浓度不变时，随着6BA浓度的增加原球茎直径有增大趋势，当6BA浓度达到一定值时，原球茎的直径出现下降趋势，培养原球茎生长的最佳培养基为1/2MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO4 80 mg/L+TIBA0.5 mg/L，原球茎直径可达3 cm（图3）。
2.5 原球茎诱导生根
将直径3 cm左右未感染的原球茎作为外植体，置于1/2MS+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 mg/L+琼脂6 mg/L诱导原球茎生根培养基上，结果表明培养25 d生根率可达100%（图4）。
2.6 朱顶红试管苗的驯化和移栽
朱顶红为球根花卉，在驯化和移栽时，容易成活。在驯化过程中，适当增加自然光照时间可以提高移栽成活率。当根数达到2～4条、根长2～4 cm时，可以驯化移栽。先揭开三角瓶瓶口，在培养室内放置1 d，然后用镊子取出植株，洗掉根部附着的培养基，栽于蛭石∶腐殖土∶珍珠岩=1∶1∶1的基质上，保持基质湿润， 10 d后小植株成活，成活率可达95%以上（图5）。
3 结论与讨论
诱导形成原球茎是朱顶红组织培养快繁技术的关键问题，如何快速诱导愈伤组织和原球茎、增加愈伤组织和原球茎增殖数量成为解决关键问题的重要内容。张松等[7]、张亚玲等[8]对朱頂红组织培养快繁途径研究指出，不同激素配比的MS培养基，先诱导形成愈伤组织，再形成不定芽或胚状体，能提高不定芽诱导率。高年春等[9]认为诱导朱顶红不定芽1/2MS培养基比MS好，并指出在培养基中添加活性炭可以提高不定芽诱导率。这些研究者从不同角度研究了提高不定芽或胚状体诱导率技术。在植物组织培养中，再生植物形态发生的过程一般划分为愈伤组织形成和器官发生2个阶段，这2个阶段因不同的植物取材部位不同，其培养效果有显著差异[10-11]。同一植物取自不同器官、组织的外植体，其形态发生也有很大差异。该研究认为影响朱顶红愈伤组织和原球茎诱导率主要因素是激素组合，通过研究不同的激素组合，筛选出能快速诱导愈伤组织和原球茎、提高愈伤组织和原球茎增殖数量的最佳培养基。该研究表明，MS+6BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L培养基能快速从鳞茎诱导出愈伤组织，诱导率也较高（80%）；以MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L为培养基诱导原球茎增殖数量最佳；原球茎生长培养的最佳培养基为 1/2MS+6BA 4.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KH2PO4 80 mg/L+TIBA 0.5 mg/L。
参考文献
[1]韦三立.花卉组织培养[M].北京：中国林业出版社，2001
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[3] 张松，达克东，曹辰兴，等.朱顶红离体培养快速繁殖体系及杯壮体发生[J].园艺报，2002，29（3）：285-287.
[4] 王红芳，贾春兰.园艺植物组培苗工厂化生产（三）—优良品种的快速繁殖[J].农村实用工程技术，1996（1）：2.
[5] 鲁红学，彭跃峰，熊定志. 朱顶红鳞茎提取物的抑菌作用研[J].安徽农业科学，2006（9）：19061907.
[6] 蒋新龙，蒋益花.朱顶红花红色素的提取条件及理化性质[J].浙江农业学报，2006，18（2）：113-117.
[7] 张松，达克东，曹辰兴.朱顶红离体培养快速繁殖体系及胚状体发生[J].园艺学报，2002（3）：285-287.
[8] 张亚玲，张延龙，原雅玲.6BA和NAA对朱顶红组织培养的影响[J].陕西林业科技，2006（1）：7-9.
[9] 高年春，杨 怡，曹荣祥.几个杂交朱顶红品种不定芽诱导试验[J].江苏农业科学，2003（6）：80-82.
[10] 曹孜义. 实用组织培养技术教程[M].兰州： 甘肃科技出版社，2001.
[11] 王爱勤，周歧伟，何龙飞，等. 百合试管结鳞茎的研究[J].广西农业大学学报，1998， 17（1）：71-75.