【摘 要】
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异源表达鲍曼不动杆菌AB0057的UDP-葡萄糖4-差向异构酶并表征其酶学性质以及分析其结构与功能.将异构酶基因构建到pET-28a表达载体并在大肠埃希菌BL21(DE3)中异源表达,使用高效液相色谱检测酶活力及表征酶学性质.系统发育分析、序列比对、同源建模与分子对接分析其结构与关键催化位点.结果显示,重组酶Gne1获得可溶性表达,质量约为38.9 kD,催化最适温度为44℃,最适pH为6.0,米氏常数KM与催化常数kcat分别为(1.227±0.0824)mmol/L和(82.64±3.562)×10-
【机 构】
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上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室,上海200240;中国药科大学生命科学技术学院,南京210009
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异源表达鲍曼不动杆菌AB0057的UDP-葡萄糖4-差向异构酶并表征其酶学性质以及分析其结构与功能.将异构酶基因构建到pET-28a表达载体并在大肠埃希菌BL21(DE3)中异源表达,使用高效液相色谱检测酶活力及表征酶学性质.系统发育分析、序列比对、同源建模与分子对接分析其结构与关键催化位点.结果显示,重组酶Gne1获得可溶性表达,质量约为38.9 kD,催化最适温度为44℃,最适pH为6.0,米氏常数KM与催化常数kcat分别为(1.227±0.0824)mmol/L和(82.64±3.562)×10-3·min-1.该酶属于NADB_Rossmann超家族并分属于UDP_G4E_1_SDR_e亚组,分别具有典型GXGXXG基序与YXXXK基序.N端结构域与NAD结合,而C端结构域用来结合底物,催化关键位点为S125和Y150.本研究验证了Gne1的差向异构酶活性,阐释了其序列特点和结构特征,揭示了其与底物、辅因子的结合模式,分析了关键催化位点.为蛋白质工程改造提高酶活力进而利用生物酶法合成稀有功能糖提供了理论依据.
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