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[摘要] 目的 探讨5-脂氧化酶（5-LO）通路在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的作用。 方法 将4周龄ApoE-/-雄性小鼠16只随机分为两组：对照组（普通饲料）、NASH模型组（高脂高胆固醇饲料）。连续喂养12周后，肝组织油红染色观察脂肪变，采用HE染色进行NAFLD活动度评分（NAFLD activity score，NAS）。荧光定量RT-PCR检测5-LO、BLT1等mRNA表达，Western Bot法检测5-LO蛋白，酶联免疫法检测肝脏白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）。 结果 高脂高胆固醇饮食12周能诱导ApoE-/-小鼠出现NASH表现，建模成功。NASH模型组较对照组肝组织5-LO mRNA及蛋白表达明显升高（P<0.01），肝匀浆LTB4水平[（71.09±18.23）pg/mL vs （46.71±11.71） pg/mL]升高（P<0.01），其受体BLT1 mRNA水平显著升高（P<0.01），中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组明显升高（P<0.01）。 结论 5-LO炎症通路通过上调中性粒细胞粘附浸润相关因子，诱导中性粒细胞浸润，促进非酒精性脂肪性肝炎进展。
[关键词] 5-脂氧化酶；脂肪性肝炎；非酒精性；中性粒细胞
[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）28-0035-04
随着人们饮食和生活方式的改变，与肥胖和代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）相关的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病率逐年攀升，在普通人群中发病率达30%以上，而在肥胖个体中甚至达到80%以上，严重威胁人类健康[1]。既往研究表明，肝小叶内中性粒细胞[neutrophil，也称多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）]浸润是NASH早期的特征性病理改变[2]，但经典TLR4 致炎信号通路激活不能完全解释其发病。新近研究显示，5-LO炎症通路异常激活在MetS相关疾病包括肥胖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等疾病中参与系统性慢性低度炎症的形成[3，4]，敲除5-LO 或BLT1 基因可使小鼠异常代谢表型明显减轻[5，6]；但目前相关研究更多集中在外周脂肪组织，这条致炎通路在NASH早期肝小叶内PMNs 浸润过程中作用如何有待进一步研究。本研究利用ApoE基因敲除（ApoE-/-）的高脂高胆固醇饮食诱导NASH小鼠模型，观察该通路异常在NASH早期肝小叶内中性粒细胞浸润过程中的可能作用。
1材料与方法
1.1 动物模型的建立及取材
SPF级4周龄C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠16只（购于南京大学国家遗传工程小鼠资源库），饲养于杭州师范大学动物实验中心SPF级动物房，适应性饲养1周后，随机均分为两组：对照组（n=8）予普通饲料喂养； NASH模型组（n=8）予高脂高胆固醇饲料（D12079B，Reasearch Diet，美国）喂养。连续喂养12周后处死动物，常规采集血清标本，由肝左叶固定部位取材，制备肝脏石蜡切片和冰冻切片，其余肝组织-80℃冷冻保存备用。本研究获杭州师范大学伦理委员会审查通过。
1.2肝脏病理学检查
肝脏冰冻切片行油红O染色观察肝细胞脂肪变，石蜡切片HE染色观察肝细胞脂肪变性程度、气球样变、小叶内及汇管区炎症程度以计算NAFLD活动度计分（NAFLD activity score，NAS）。
1.3 荧光定量RT-PCR
取适量肝组织，Trizol法提取总RNA，取总RNA 2 μg采用逆转录试剂盒（Roche）合成cDNA，再将逆转录产物3 μL在荧光定量PCR仪进行PCR扩增，以18S为内参，以2-ΔΔCT比较相关基因的表达水平，各基因引物见表1。
1.4 Western Blot
取适量肝组织用RIPA裂解液裂解，上清液行蛋白浓度测定后，将等量样品加入5X蛋白上样缓冲液，95℃ 5 min变性。各组蛋白上样50 μg，用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行常规电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭30 min，按1∶1 000 加入兔抗小鼠5-LO（Abcam）一抗及兔抗小鼠β-actin（CST）一抗，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3次。按1∶5000加入山羊抗兔IgG（Abcam）二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜3次，化学发光成像系统采集图像并进行分析。
1.5肝组织LTB4检测
取肝组织15 mg加入生理盐水500 μL进行匀浆，采用SPE（C-18）柱形筒（CAYMAN）萃取待检液，根据ELISA试剂盒（CAYMAN）说明书进行检测。
1.6 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，方差不齐则采用秩和检验，计量资料相关性分析采用Pearson检验。双侧P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。
2 结果
2.1 肝组织病理学变化
油紅O染色结果显示：对照组小鼠肝组织无明显脂肪变，NASH模型组则出现明显脂肪变。HE染色结果显示：对照组肝脏肝小叶及门管区结构清晰，未见明显脂肪变、气球样变以及炎症细胞浸润；NASH模型组肝细胞出现弥漫性脂肪变及不同程度气球样变，肝小叶内有明显炎症细胞浸润，计算NAS积分为3～7分，其中75%>4分达到NASH诊断标准。
2.2肝组织中5-LO/BLT1及相关炎症因子mRNA表达水平
NASH模型组肝组织中5-LO以及BLT1 mRNA的表达均较对照组明显升高（P<0.01），同时NASH模型组中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组明显升高（P<0.01），见图1。 2.3肝组织中5-LO、BLT1 mRNA表达水平与NAS积分的相关性分析
对NASH模型组肝组织中5-LO以及BLT1 mRNA的表达水平与NAS积分进行Pearson相关分析，结果表明：5-LO mRNA的表达水平与NAS积分呈正相关（r=0.891，P<0.01）；BLT1 mRNA的表达水平与NAS积分呈正相关（r=0.889，P<0.01）。
2.4 肝组织5-LO蛋白表达水平
NASH模型组肝组织中5-LO的蛋白表达量较对照组明显升高（图2）。
2.5肝组织LTB4水平
NASH模型组肝组织中LTB4水平为（71.09±18.23）pg/mL，较对照组的（46.71±11.71）pg/mL明显升高（t=-3.18，P<0.01）。
3 讨论
本研究用ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠辅以高脂高胆固醇饮食，模拟现代流行的饮食习惯，建立非酒精性脂肪性肝炎的动物模型。本课题组前期研究发现该模型同时伴随着血糖升高、胰岛素抵抗，合并肥胖、脂质代谢紊乱等，符合人类NASH发病过程。与前期结果一致，ApoE-/-小鼠高脂高胆固醇饮食12周能成功建立NASH模型。
中性粒细胞是外周血中数量最多的白细胞，作为最早到达炎症部位的免疫细胞，参与构成机体的第一道防线。来自本课题组以及国外研究均发现NASH早期肝小叶内存在中性粒细胞浸润这一特征性病理变化[7，8]。近年研究一致认为，以模式识别受体Toll 样受体（TLRs）和库普弗细胞（KC）为主介导的天然免疫异常介导了肝脏炎症的发生：脂肪变的肝细胞在脂质代谢中间产物所诱导的脂毒性、氧应激、内质网应激等多重刺激下释放损伤相关危险信号，激活KCs、肝星状细胞和肝实质细胞等表达的TLRs，招募炎症细胞并放大肝脏炎症[9，10]。但上述经典的发病机制并不能解释肝小叶内中性粒细胞浸润这个NASH 早期的特征性病理改变。在不同饮食配方诱导的TLR4和TLR9基因敲除小鼠NASH 模型中，仅能一定程度减轻肝脏损伤但不足以完全抑制肝脏炎症的发生[11，12]，提示尽管TLRs信号介导炎症放大过程，但在早期的炎症启动阶段可能存在着更为重要的非TLRs 依赖的炎症激活途径。
白三稀是一种经典的促炎性脂质代谢中间产物，由必需脂肪酸n-6多不饱和脂肪酸（PUFA）转化生成的花生四烯酸（AA）在5-LO催化下形成，然后经高亲和力受体BLT1和低亲和力受体BLT2表达广谱和高效的致炎效应包括释放趋化因子、招募PMNs、淋巴细胞等，其中5-LO、LTB4 和BLT1作为核心信号分子介导炎症触发和放大过程[13，14]。国外有研究发现予小鼠高脂饮食后，在肝脏和肌肉中LTB4 表达增加[15]。本研究也观察到NASH模型组肝脏LTB4分泌增加，同时发现其催化酶5-LO在mRNA及蛋白表达水平均较对照组升高，其受体BLT1水平显著升高，进一步分析5-LO、BLT1 mRNA表达量与NAS积分的相关性，结果示随着肝脏脂肪变以及炎症的进展，5-LO、BLT1mRNA表达量呈正相关。最近的研究显示高脂血症可通过调节5-LO促进中性粒细胞产生LTB4，从而导致炎症的发生[16]。因此，脂代谢异常导致的5-LO致炎信号通路可能在NASH早期炎症启动尤其是特征性的肝小叶内PMNs 浸润过程中起了重要作用，可能主要由失衡的PUFAs 中间代谢产物为此炎症过程提供了某种触发或放大信号。
外周血液中的少量哨兵PMNs 在感知特异性危险信号后可被相应部位内皮细胞捕获、阻滞、粘附并跨越内皮细胞迁移至炎症部位，同时迅速促进其他PMNs向损伤组织大量浸润。既往研究表明，组织损伤后，中性粒細胞立即释放脂质介质，导致中性粒细胞进一步激活，激活的中性粒细胞进一步释放趋化因子和炎症反应的扩大，一步激活和炎症反应的扩大，通过正反馈性的调节引起炎症瀑布[17]。在炎症性疾病比如类风湿性关节炎和过敏性哮喘疾病中，释放的LTB4通过激活中性粒细胞LTB4受体BLT1招募更多的中性粒细胞，BLT1/中性粒细胞进一步激活释放IL-1，其次诱导细胞释放CCR1、CXCR2配体，中性粒细胞的招募被趋化因子极大的放大[18，19]。本研究中观察到NASH模型组中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组明显升高，提示5-LO炎症通路通过脂质-细胞因子-趋化因子轴调控炎症反应过程，并作为初始信号触发后续细胞因子、趋化因子的释放而参与中性粒细胞或混合性炎症细胞招募和最终免疫效应的实现[20]。
本研究显示，肝细胞脂质代谢异常激活5-LO炎症通路，LTB4合成增加，促进中性粒细胞趋化因子、粘附分子释放，招募中性粒细胞向炎症部位浸润和触发后续炎症反应，造成组织损伤。肝脏5-LO、BLT1与NAS积分显著正相关，提示5-LO炎症通路在NASH的疾病进展中发挥重要作用。为明确5-LO炎症通路在NASH中的作用，本课题组将进一步利用药物阻断该炎症通路，为研究治疗NASH新的作用靶点提供实验依据。
[参考文献]
[1] Labrecque DR，Abbas Z，Anania F，et al. World Gastroenterology Organisation global guidelines：Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis[J]. Journal of Clinical Gastroenterology， 2014，48（6）：467-473.
[2] Farrell GC，Rooyen DV，Gan L，et al. NASH is an inflammatory disorder：pathogenic，Prognostic and therapeutic implications[J]. Gut
[关键词] 5-脂氧化酶；脂肪性肝炎；非酒精性；中性粒细胞
[中图分类号] R575 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）28-0035-04
随着人们饮食和生活方式的改变，与肥胖和代谢综合征（metabolic syndrome，MetS）相关的非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）发病率逐年攀升，在普通人群中发病率达30%以上，而在肥胖个体中甚至达到80%以上，严重威胁人类健康[1]。既往研究表明，肝小叶内中性粒细胞[neutrophil，也称多形核白细胞（polymorphonuclear leukocyte，PMN）]浸润是NASH早期的特征性病理改变[2]，但经典TLR4 致炎信号通路激活不能完全解释其发病。新近研究显示，5-LO炎症通路异常激活在MetS相关疾病包括肥胖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等疾病中参与系统性慢性低度炎症的形成[3，4]，敲除5-LO 或BLT1 基因可使小鼠异常代谢表型明显减轻[5，6]；但目前相关研究更多集中在外周脂肪组织，这条致炎通路在NASH早期肝小叶内PMNs 浸润过程中作用如何有待进一步研究。本研究利用ApoE基因敲除（ApoE-/-）的高脂高胆固醇饮食诱导NASH小鼠模型，观察该通路异常在NASH早期肝小叶内中性粒细胞浸润过程中的可能作用。
1材料与方法
1.1 动物模型的建立及取材
SPF级4周龄C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠16只（购于南京大学国家遗传工程小鼠资源库），饲养于杭州师范大学动物实验中心SPF级动物房，适应性饲养1周后，随机均分为两组：对照组（n=8）予普通饲料喂养； NASH模型组（n=8）予高脂高胆固醇饲料（D12079B，Reasearch Diet，美国）喂养。连续喂养12周后处死动物，常规采集血清标本，由肝左叶固定部位取材，制备肝脏石蜡切片和冰冻切片，其余肝组织-80℃冷冻保存备用。本研究获杭州师范大学伦理委员会审查通过。
1.2肝脏病理学检查
肝脏冰冻切片行油红O染色观察肝细胞脂肪变，石蜡切片HE染色观察肝细胞脂肪变性程度、气球样变、小叶内及汇管区炎症程度以计算NAFLD活动度计分（NAFLD activity score，NAS）。
1.3 荧光定量RT-PCR
取适量肝组织，Trizol法提取总RNA，取总RNA 2 μg采用逆转录试剂盒（Roche）合成cDNA，再将逆转录产物3 μL在荧光定量PCR仪进行PCR扩增，以18S为内参，以2-ΔΔCT比较相关基因的表达水平，各基因引物见表1。
1.4 Western Blot
取适量肝组织用RIPA裂解液裂解，上清液行蛋白浓度测定后，将等量样品加入5X蛋白上样缓冲液，95℃ 5 min变性。各组蛋白上样50 μg，用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行常规电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭30 min，按1∶1 000 加入兔抗小鼠5-LO（Abcam）一抗及兔抗小鼠β-actin（CST）一抗，4℃孵育过夜。TBST 洗膜3次。按1∶5000加入山羊抗兔IgG（Abcam）二抗，室温孵育1 h，TBST 洗膜3次，化学发光成像系统采集图像并进行分析。
1.5肝组织LTB4检测
取肝组织15 mg加入生理盐水500 μL进行匀浆，采用SPE（C-18）柱形筒（CAYMAN）萃取待检液，根据ELISA试剂盒（CAYMAN）说明书进行检测。
1.6 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，方差不齐则采用秩和检验，计量资料相关性分析采用Pearson检验。双侧P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有高度统计学意义。
2 结果
2.1 肝组织病理学变化
油紅O染色结果显示：对照组小鼠肝组织无明显脂肪变，NASH模型组则出现明显脂肪变。HE染色结果显示：对照组肝脏肝小叶及门管区结构清晰，未见明显脂肪变、气球样变以及炎症细胞浸润；NASH模型组肝细胞出现弥漫性脂肪变及不同程度气球样变，肝小叶内有明显炎症细胞浸润，计算NAS积分为3～7分，其中75%>4分达到NASH诊断标准。
2.2肝组织中5-LO/BLT1及相关炎症因子mRNA表达水平
NASH模型组肝组织中5-LO以及BLT1 mRNA的表达均较对照组明显升高（P<0.01），同时NASH模型组中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组明显升高（P<0.01），见图1。 2.3肝组织中5-LO、BLT1 mRNA表达水平与NAS积分的相关性分析
对NASH模型组肝组织中5-LO以及BLT1 mRNA的表达水平与NAS积分进行Pearson相关分析，结果表明：5-LO mRNA的表达水平与NAS积分呈正相关（r=0.891，P<0.01）；BLT1 mRNA的表达水平与NAS积分呈正相关（r=0.889，P<0.01）。
2.4 肝组织5-LO蛋白表达水平
NASH模型组肝组织中5-LO的蛋白表达量较对照组明显升高（图2）。
2.5肝组织LTB4水平
NASH模型组肝组织中LTB4水平为（71.09±18.23）pg/mL，较对照组的（46.71±11.71）pg/mL明显升高（t=-3.18，P<0.01）。
3 讨论
本研究用ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠辅以高脂高胆固醇饮食，模拟现代流行的饮食习惯，建立非酒精性脂肪性肝炎的动物模型。本课题组前期研究发现该模型同时伴随着血糖升高、胰岛素抵抗，合并肥胖、脂质代谢紊乱等，符合人类NASH发病过程。与前期结果一致，ApoE-/-小鼠高脂高胆固醇饮食12周能成功建立NASH模型。
中性粒细胞是外周血中数量最多的白细胞，作为最早到达炎症部位的免疫细胞，参与构成机体的第一道防线。来自本课题组以及国外研究均发现NASH早期肝小叶内存在中性粒细胞浸润这一特征性病理变化[7，8]。近年研究一致认为，以模式识别受体Toll 样受体（TLRs）和库普弗细胞（KC）为主介导的天然免疫异常介导了肝脏炎症的发生：脂肪变的肝细胞在脂质代谢中间产物所诱导的脂毒性、氧应激、内质网应激等多重刺激下释放损伤相关危险信号，激活KCs、肝星状细胞和肝实质细胞等表达的TLRs，招募炎症细胞并放大肝脏炎症[9，10]。但上述经典的发病机制并不能解释肝小叶内中性粒细胞浸润这个NASH 早期的特征性病理改变。在不同饮食配方诱导的TLR4和TLR9基因敲除小鼠NASH 模型中，仅能一定程度减轻肝脏损伤但不足以完全抑制肝脏炎症的发生[11，12]，提示尽管TLRs信号介导炎症放大过程，但在早期的炎症启动阶段可能存在着更为重要的非TLRs 依赖的炎症激活途径。
白三稀是一种经典的促炎性脂质代谢中间产物，由必需脂肪酸n-6多不饱和脂肪酸（PUFA）转化生成的花生四烯酸（AA）在5-LO催化下形成，然后经高亲和力受体BLT1和低亲和力受体BLT2表达广谱和高效的致炎效应包括释放趋化因子、招募PMNs、淋巴细胞等，其中5-LO、LTB4 和BLT1作为核心信号分子介导炎症触发和放大过程[13，14]。国外有研究发现予小鼠高脂饮食后，在肝脏和肌肉中LTB4 表达增加[15]。本研究也观察到NASH模型组肝脏LTB4分泌增加，同时发现其催化酶5-LO在mRNA及蛋白表达水平均较对照组升高，其受体BLT1水平显著升高，进一步分析5-LO、BLT1 mRNA表达量与NAS积分的相关性，结果示随着肝脏脂肪变以及炎症的进展，5-LO、BLT1mRNA表达量呈正相关。最近的研究显示高脂血症可通过调节5-LO促进中性粒细胞产生LTB4，从而导致炎症的发生[16]。因此，脂代谢异常导致的5-LO致炎信号通路可能在NASH早期炎症启动尤其是特征性的肝小叶内PMNs 浸润过程中起了重要作用，可能主要由失衡的PUFAs 中间代谢产物为此炎症过程提供了某种触发或放大信号。
外周血液中的少量哨兵PMNs 在感知特异性危险信号后可被相应部位内皮细胞捕获、阻滞、粘附并跨越内皮细胞迁移至炎症部位，同时迅速促进其他PMNs向损伤组织大量浸润。既往研究表明，组织损伤后，中性粒細胞立即释放脂质介质，导致中性粒细胞进一步激活，激活的中性粒细胞进一步释放趋化因子和炎症反应的扩大，一步激活和炎症反应的扩大，通过正反馈性的调节引起炎症瀑布[17]。在炎症性疾病比如类风湿性关节炎和过敏性哮喘疾病中，释放的LTB4通过激活中性粒细胞LTB4受体BLT1招募更多的中性粒细胞，BLT1/中性粒细胞进一步激活释放IL-1，其次诱导细胞释放CCR1、CXCR2配体，中性粒细胞的招募被趋化因子极大的放大[18，19]。本研究中观察到NASH模型组中性粒细胞趋化因子和相应受体MIP2、CXCR2以及黏附分子ICAM1、VCAM1 mRNA的表达均较对照组明显升高，提示5-LO炎症通路通过脂质-细胞因子-趋化因子轴调控炎症反应过程，并作为初始信号触发后续细胞因子、趋化因子的释放而参与中性粒细胞或混合性炎症细胞招募和最终免疫效应的实现[20]。
本研究显示，肝细胞脂质代谢异常激活5-LO炎症通路，LTB4合成增加，促进中性粒细胞趋化因子、粘附分子释放，招募中性粒细胞向炎症部位浸润和触发后续炎症反应，造成组织损伤。肝脏5-LO、BLT1与NAS积分显著正相关，提示5-LO炎症通路在NASH的疾病进展中发挥重要作用。为明确5-LO炎症通路在NASH中的作用，本课题组将进一步利用药物阻断该炎症通路，为研究治疗NASH新的作用靶点提供实验依据。
[参考文献]
[1] Labrecque DR，Abbas Z，Anania F，et al. World Gastroenterology Organisation global guidelines：Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis[J]. Journal of Clinical Gastroenterology， 2014，48（6）：467-473.
[2] Farrell GC，Rooyen DV，Gan L，et al. NASH is an inflammatory disorder：pathogenic，Prognostic and therapeutic implications[J]. Gut