94. BPD致XEM2细胞DNA加合物水平的检测

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随着我国工矿企业的发展,人口密集的工业城市不断扩建,交通运输车辆与燃料的消耗量日益增加,因而环境中苯并(a)芘(B(a)P)与其他多环芳烃(PAH)的污染也日趋严重。早在1983年国际癌症研究机构就将B(a)P列为人类致癌物。BPD(Benzo(a)pyrene-7,8-trans-dihydroxy-diol)是B(a)P的代谢产物,此种衍生物再经混合功能氧化酶的催化形成二氢二醇环氧苯并(a)芘(BPDE),它可以与DNA的亲核位点鸟嘌呤外环胺基端共价结合,形成DNA加合物。本试验用不同浓度的BPD对能够表达CYPIAI的V79细胞的衍生株XEM2细胞染毒3 h,之后提取细胞DNA,用改良的核酸酶PI富集的 32P-后标记法测定DNA加合物。其主要步骤为:①在含有加合物的DNA中加入牛脾磷酸二酯酶与微球菌内切酶,使DNA链完全降解为3’单磷酸核苷;②加入核酸酶PI,它可选择性地作用于正常未结合外来化合物的单核苷酸3’-OH末端,使之去磷酸化,而与外来化合物形成加合物的单核苷酸可抵制这一作用,这样可以通过消除正常核苷酸来富集加合物核苷酸;③再在反应体系中加入特异的-32P-ATP多聚核苷酸激酶(T4PNK),将具有高度特异活性的 32P-ATP的磷酸根基因转移到加合的核苷酸5’-OH末端,使其形成3’,5’二磷酸核苷,而已去磷酸化的单核苷酸则不能;④将标记的加合物通过薄层层析技术分离;⑤放射自显影确定各加合物在PEI-cellulose层析板上的位置;⑥定量分析以液闪仪进行CPM计算,计算加合物水平。
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