【摘 要】
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采用常规转化方法用来自天蓝色链霉菌J1501的质粒pUC1169(pMT660::Tn4556::vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型7100的原生质体,均未得到转化子.采用限制性热衰
【机 构】
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中国农业大学生物学院,北京,100094中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国科学院微生物研究所,北京,100080;中国农业大学生物学院,北京,100094;
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采用常规转化方法用来自天蓝色链霉菌J1501的质粒pUC1169(pMT660::Tn4556::vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型7100的原生质体,均未得到转化子.采用限制性热衰减法于50°C,30min溶菌制备7100的原生质体,获得了转化子,但转化频率极低,只有0.4个转化子/μg DNA.用来自7100的pUC1169再转化不含pUC1169的7100原生质体,转化频率提高103～104倍.于39℃,MM/Vio条件下培养携带有pUC1169的7100孢子,Tn4560发生转座,筛选到4068个转座菌落,并从中得到8株尼可霉素阻断突变株;对这8株突变株的总DNA进行Southem杂交分析表明,Tn4560至少在4个不同的位点插入到7100的染色体上.用实验室已获得的与尼可霉素生物合成有关的30kb DNA片段为探针和经不同酶切的8株突变株的总DNA进行Southem杂交,结果表明,除阻断突变株Nik5有杂交信号且杂交信号大小均同野生型7100外,其余7株突变株均无任何杂交信号.HPLC分析表明,8株突变株在产生尼可霉素方面可分为两种类型,Nik5为1种类型,其余7株为另一种类型.初步推测这7株突变株基因组DNA与尼可霉素生物合成有关的部分发生了大片断的缺失.以Tn4560为探针,构建Nik5的部分基因文库,克隆到Tn4560侧翼4.2kb和0.6kb的染色体DNA片断,并对这两个DNA片段进行了序列分析,结果表明4.8kb的DNA片段含有两个完整的开放阅读框和一个不完整的开放阅读框,此DNA片段已送GenBank注册,登记号为AF349618.rn
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