【摘 要】
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目的 构建GPC3基因真核表达重组质粒,观察GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进肝癌细胞增殖的影响.方法 自行设计引物从GPC3原核扩增重组质粒pDNR-LIB.GPC3中获得编码GPC3的基因片
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目的 构建GPC3基因真核表达重组质粒,观察GPC3对生长因子FGF2、IGF2促进肝癌细胞增殖的影响.方法 自行设计引物从GPC3原核扩增重组质粒pDNR-LIB.GPC3中获得编码GPC3的基因片段.应用基因重组技术,将GPC3基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-N2中,然后经脂质体介导转染SK-Hep-1,并通过C418(600 mg/L)筛选出抗性克隆,应用荧光显微镜及逆转录-聚合酶链反应(RT-PER)法对转染细胞内pEGFP-GPC3的表达进行鉴定,采用噻唑蓝(MTT)比色法研究GPC3对生长因子FGF2、IGF2促细胞增殖效应的影响.结果 限制性内切酶酶切分析、重组质粒测序鉴定表明为正确重组子,荧光显微镜下可见转染的SK-Hep-1胞膜区发出强绿色荧光,RT-PCR表明GPC3在SK-Hep-1中成功表达,生长因子实验中,GPC3明显抑制FGF2促细胞增殖效应,与空质粒转染组比较差异有统计学意义(P0.05).结论 测序表明,编码的氨基酸序列与人GPC3完全一致;构建完成真核表达重组质粒pEGFP-N2-GPC3;GPC3基因在SK-Hep-1中成功表达;GPC3在FGF2信号通路中可能发挥负性调控因子的作用.
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