【摘 要】
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目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑，评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞毒性，转染后接种病毒观察细胞病变作用(CPE)，荧光定量RT-PCR法检测EV71含量，免疫共沉淀结合荧光定
【机 构】
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210009 南京，江苏省疾病预防控制中心 卫生部肠道病原微生物重点实验室,210009 南京，江苏省疾病预防控制中心 卫生部肠道病原微生物重点实验室,210009 南京，江苏省疾病预防控制中心 卫生
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目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑，评价其抑制EV71复制的效应。
方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞毒性，转染后接种病毒观察细胞病变作用(CPE)，荧光定量RT-PCR法检测EV71含量，免疫共沉淀结合荧光定量RT-PCR法测定Cas9-gRNA在细胞内与EV71 RNA特异性结合的能力。
结果成功构建pCas-Guide-GFP-G1表达质粒；转染细胞后未见明显细胞毒性效应；细胞转染后接种病毒发现pCas-Guide-GFP-G1＋PAM1组细胞病变明显少于其他对照组；培养上清中EV71含量较对照组降低了40.4%(P＝0.056)，细胞中EV71含量较对照组降低了52.8%(P＝0.014)；pCas-Guide-GFP-G1＋PAM1组在细胞内与EV71 RNA特异性结合能力最高。
结论针对EV71的VP4基因设计的CRISPR/Cas9表达质粒在特定PAM存在下能通过对EV71基因组的剪切实现抑制EV71病毒复制的作用，可以为EV71治疗提供新的途径。
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