【摘 要】
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目的 获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白).方法 PCR扩增获得B、C基因型乙型肝炎病毒X基因,以AgeⅠ及BglⅡ位点将其克隆入果蝇表达载体pMT/BiP/V5/HisC.重组载体
【机 构】
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福建医科大学分子医学研究中心,福建省高校感染与肿瘤重点实验室,福建福州,350004
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目的 获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白(HBx蛋白).方法 PCR扩增获得B、C基因型乙型肝炎病毒X基因,以AgeⅠ及BglⅡ位点将其克隆入果蝇表达载体pMT/BiP/V5/HisC.重组载体与筛选质粒pCoBlast以脂质体Cellfectine共转染果蝇S2细胞,25 μg/ml Blasticidin筛选多克隆抗性细胞株.扩增细胞以CuSO4诱导HBx蛋白表达,Western blot鉴定表达产物并确定最佳蛋白表达时间和诱导浓度.200 ml大规模培养细胞并诱导表达,一步法及两步法分别纯化B、C基因型HBx蛋白.结果 成功构建重组表达载体pMT/BiP-HBxb(含B基因型HBx基因)和pMT/BiP-HBxc(含 C基因型HBx基因).在果蝇S2细胞中,B、C基因型HBx蛋白与6×His融合表达(分别为HBxb-His及HBxc-His),在CuSO4诱导后72 h以及诱导浓度为500 μmol/L～1 mmol/L时蛋白表达量最高.在200 ml培养液中,一步法纯化所得HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为1.52和1.37 mg,纯度为85.23%和84.59%;二步法所得的HBxb-His及HBxc-His蛋白总量分别为5.38和6.42 mg,纯度分别为95.36%和94.62%.结论 在果蝇表达系统中表达并获得高纯度B、C基因型乙型肝炎病毒X蛋白,为进一步探讨结构和功能的关系奠定了基础.
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