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摘 要：采集浙江东部5地泥鳅群体样本，利用流式细胞仪检测泥鳅染色体倍体，使用光学显微镜分析其核型，为其种质分析提供参数；采用体内注射植物血凝素（PHA）和秋水仙素，提取头肾组织，采用空气干燥制片法制作泥鳅染色体标本。结果表明：浙江东部各水系的泥鳅均为二倍体，核型公式为2n=8m+6sm+36t，NF=64。
关键词：泥鳅；染色体倍性；染色体核型；浙江东部
中图分类号 S966.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）18-116-02
泥鳅隶属鲤形目鳅科泥鳅属，是广泛分布于浙江省各水体的小型鱼类，也是鳅科鱼类中最有经济价值的一种。经过近几年的人工养殖，泥鳅市场愈发成熟，销售量稳中有升；各地泥鳅亲本来源也愈发复杂，各养殖场泥鳅亲本混杂养殖规格差异较大。为了探索适合浙江省的泥鳅种质资源，笔者采集了浙江省多地的泥鳅野生群体进行倍性分析和核型检测，为泥鳅进一步育种工作提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料 2012年9～10月，在浙江省东部的桐乡石门镇、宁波澥浦、临海汛桥、瑞安龙湖镇和温州鳌江采集泥鳅样本。泥鳅全长122～198mm，体重7.04～37.96g。
1.2 实验试剂 实验试剂见表1。
表1 制作染色体标本药品
[药品名＼&纯度＼&销售商＼&氯化钠（NaCl）＼&分析纯＼&天津市广成化学试剂有限公司＼&氯化钾（KCl）＼&分析纯＼&天津市广成化学试剂有限公司＼&无水甲醇＼&≥99.9%＼&天津市广成化学试剂有限公司＼&秋水仙素＼&95%＼&生兴生物技术（南京）有限公司＼&乙酸＼&36%＼&国药集团化学试剂有限公司＼&聚羟基脂肪酸脂（PHA）＼&＼&广州医药工业研究所＼&Gimesa染液＼&＼&北京康倍斯科技有限公司＼&]
1.3 泥鳅暂养 将收集来的泥鳅经10mg·L-1的聚维酮碘浸泡30min后暂养于120L水箱中，日投喂沉性颗粒饲料20g。
1.4 倍性检测 每个样本按采集数量进行倍性检测。将样品采用100mg·L-1MS222麻醉后，用装有抗凝剂的1mL注射器通过尾椎抽血的方法抽取泥鳅血液，通过PBS溶液稀释至血细胞浓度为106个·mL-1，冰上保存待测。以实验已确认的二倍体泥鳅血样为内参，经DAPI染液染色，大鳞副泥鳅血样∶待测组血样∶DAPI=1∶1∶2，染色5min后，使用流式细胞仪（Cell Lab QuantaTMSC，Beckman Coulter）进行检测。
1.5 染色体标本提取 从各群体中各取10尾泥鳅进行标本提取。参考国标方法进行实验[1]。泥鳅按50μg·g-1剂量从腹腔注入植物血凝素（PHA）饲养于22～25℃45L的水箱中，24h后腹腔注射20μg·g-1秋水仙素，培养3h后，剪断鳃部血管，将鱼体倒挂，待血液不再流出后，解剖取头肾。将头肾置于装有0.75%生理盐水的1mL离心管中清洗，后取出头肾转入1mL离心管中滴入2滴0.75%生理盐水，用研磨棒研磨过120目筛，取细胞悬液，转入5mL离心管中，离心（3 000r/min）5min后，吸去液体，加入75mmol·L-1KCl溶液4mL，用移液枪吹打后静置30min，离心（3 000r/min）5min后，加入固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）4mL，吹打均匀后静置固定，然后离心（3 000r/min）重复3次。最后加入4mL固定液吹打均匀。用滴管吸取悬液，悬空滴在冷冻玻片上，酒精灯加热烘干，Giemsa染色，待常温干燥后，镜检。
1.6 核型分析 在显微镜油镜视野中选取50个染色体中期分裂相进行染色体计数。染色体类型按照Levan等[2]的标准确定。数据用Excel和SPSS 18.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 倍性鉴定 经流式细胞仪检测，采集到的泥鳅样品均为二倍体，没有发现四倍体（表2、图1）。
2.2 染色体核型分析 在油镜下选取分散良好、形态清晰的分裂相进行分析，选择500个中期分裂相进行统计，见图2。如图2所示，染色体数目为50的分裂相占79.2%，占大多数。
由图3可知，泥鳅的50对染色体中，中部着丝点染色体（m）4对，亚中部着丝点染色体（sm）3对，端部着丝点染色体（t）18对。组型公司为2n=8m+6sm+36t，臂数（NF）：64。对泥鳅染色体进行进一步分析，结果见表3。
3 结论
3.1 泥鳅的倍性 目前在我国已发现的泥鳅群体有二倍体、三倍体、四倍体和六倍体[3-6]，不同倍体的泥鳅混杂出现并无一定规律，目前的泥鳅不同倍体的发现均为通过实地采样分析所得，暂无相关理论验证。通过采样调查，尚未在浙江省东部发现多倍体泥鳅。
3.2 泥鳅核型与地理种群 有研究表明，泥鳅存在明显的地理种群现象[7-9]，而有学者则认为泥鳅属区域性分布不明显[10]。通过本次实验表明，浙江省东部各地泥鳅核型一致，从染色体核型分析上尚不能进行有效的区分，需要进一步的进行染色体分析实验。
参考文献
[1]GB/T 18654-2008养殖鱼类种质检验[S].2008.
[2]Lejeune，J.A PROPOSED STANDARD SYSTEM OF NOMENCLATURE OF HUMAN MITOTIC CHROMOSOMES[J].The Lancet，1960，275（7133）：1063-1065.
[3]印杰，赵振山，陈小奇，等.二倍体和四倍体泥鳅染色体组型比较[J].水生生物学报，2005，29（4）：469-472.
[4]王元军.南四湖泥鳅资源现状及开发[J].水利渔业，2005（04）：61-66.
[5]曾柳根，张伟，甘云飞，等.鄱阳湖泥鳅遗传多样性研究[J].水生生物学报，2010，34（5）：966-972.
[6]周玲玲，张桂蓉，魏开建，等.同域分布二倍体和四倍体泥鳅群体的遗传结构[J].华中农业大学学报，2011（05）：624-630.
[7]马纲.中国淡水鱼类染色体形态及其数目变异的研究进展[J].甘肃科学学报，1996，8（3）：77-80.
[8]王军萍，戴秀君，韩希福.河北省三种鳅科鱼类的染色体组型[J].河北大学学报（自然科学版），1993，13（3）：51-54.
[9]常重杰，余其兴.泥鳅Ag-NORs带和C带研究[J].河南师范大学学报（自然科学版），2000，28（2）：71-73.
[10]陈景星.中国花鳅亚科鱼类系统分类的研究[A]//鱼类学论文集（第一集）[C].北京：科学出版社，1981：21-32. （责编：张宏民）
关键词：泥鳅；染色体倍性；染色体核型；浙江东部
中图分类号 S966.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）18-116-02
泥鳅隶属鲤形目鳅科泥鳅属，是广泛分布于浙江省各水体的小型鱼类，也是鳅科鱼类中最有经济价值的一种。经过近几年的人工养殖，泥鳅市场愈发成熟，销售量稳中有升；各地泥鳅亲本来源也愈发复杂，各养殖场泥鳅亲本混杂养殖规格差异较大。为了探索适合浙江省的泥鳅种质资源，笔者采集了浙江省多地的泥鳅野生群体进行倍性分析和核型检测，为泥鳅进一步育种工作提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料 2012年9～10月，在浙江省东部的桐乡石门镇、宁波澥浦、临海汛桥、瑞安龙湖镇和温州鳌江采集泥鳅样本。泥鳅全长122～198mm，体重7.04～37.96g。
1.2 实验试剂 实验试剂见表1。
表1 制作染色体标本药品
[药品名＼&纯度＼&销售商＼&氯化钠（NaCl）＼&分析纯＼&天津市广成化学试剂有限公司＼&氯化钾（KCl）＼&分析纯＼&天津市广成化学试剂有限公司＼&无水甲醇＼&≥99.9%＼&天津市广成化学试剂有限公司＼&秋水仙素＼&95%＼&生兴生物技术（南京）有限公司＼&乙酸＼&36%＼&国药集团化学试剂有限公司＼&聚羟基脂肪酸脂（PHA）＼&＼&广州医药工业研究所＼&Gimesa染液＼&＼&北京康倍斯科技有限公司＼&]
1.3 泥鳅暂养 将收集来的泥鳅经10mg·L-1的聚维酮碘浸泡30min后暂养于120L水箱中，日投喂沉性颗粒饲料20g。
1.4 倍性检测 每个样本按采集数量进行倍性检测。将样品采用100mg·L-1MS222麻醉后，用装有抗凝剂的1mL注射器通过尾椎抽血的方法抽取泥鳅血液，通过PBS溶液稀释至血细胞浓度为106个·mL-1，冰上保存待测。以实验已确认的二倍体泥鳅血样为内参，经DAPI染液染色，大鳞副泥鳅血样∶待测组血样∶DAPI=1∶1∶2，染色5min后，使用流式细胞仪（Cell Lab QuantaTMSC，Beckman Coulter）进行检测。
1.5 染色体标本提取 从各群体中各取10尾泥鳅进行标本提取。参考国标方法进行实验[1]。泥鳅按50μg·g-1剂量从腹腔注入植物血凝素（PHA）饲养于22～25℃45L的水箱中，24h后腹腔注射20μg·g-1秋水仙素，培养3h后，剪断鳃部血管，将鱼体倒挂，待血液不再流出后，解剖取头肾。将头肾置于装有0.75%生理盐水的1mL离心管中清洗，后取出头肾转入1mL离心管中滴入2滴0.75%生理盐水，用研磨棒研磨过120目筛，取细胞悬液，转入5mL离心管中，离心（3 000r/min）5min后，吸去液体，加入75mmol·L-1KCl溶液4mL，用移液枪吹打后静置30min，离心（3 000r/min）5min后，加入固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）4mL，吹打均匀后静置固定，然后离心（3 000r/min）重复3次。最后加入4mL固定液吹打均匀。用滴管吸取悬液，悬空滴在冷冻玻片上，酒精灯加热烘干，Giemsa染色，待常温干燥后，镜检。
1.6 核型分析 在显微镜油镜视野中选取50个染色体中期分裂相进行染色体计数。染色体类型按照Levan等[2]的标准确定。数据用Excel和SPSS 18.0进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 倍性鉴定 经流式细胞仪检测，采集到的泥鳅样品均为二倍体，没有发现四倍体（表2、图1）。
2.2 染色体核型分析 在油镜下选取分散良好、形态清晰的分裂相进行分析，选择500个中期分裂相进行统计，见图2。如图2所示，染色体数目为50的分裂相占79.2%，占大多数。
由图3可知，泥鳅的50对染色体中，中部着丝点染色体（m）4对，亚中部着丝点染色体（sm）3对，端部着丝点染色体（t）18对。组型公司为2n=8m+6sm+36t，臂数（NF）：64。对泥鳅染色体进行进一步分析，结果见表3。
3 结论
3.1 泥鳅的倍性 目前在我国已发现的泥鳅群体有二倍体、三倍体、四倍体和六倍体[3-6]，不同倍体的泥鳅混杂出现并无一定规律，目前的泥鳅不同倍体的发现均为通过实地采样分析所得，暂无相关理论验证。通过采样调查，尚未在浙江省东部发现多倍体泥鳅。
3.2 泥鳅核型与地理种群 有研究表明，泥鳅存在明显的地理种群现象[7-9]，而有学者则认为泥鳅属区域性分布不明显[10]。通过本次实验表明，浙江省东部各地泥鳅核型一致，从染色体核型分析上尚不能进行有效的区分，需要进一步的进行染色体分析实验。
参考文献
[1]GB/T 18654-2008养殖鱼类种质检验[S].2008.
[2]Lejeune，J.A PROPOSED STANDARD SYSTEM OF NOMENCLATURE OF HUMAN MITOTIC CHROMOSOMES[J].The Lancet，1960，275（7133）：1063-1065.
[3]印杰，赵振山，陈小奇，等.二倍体和四倍体泥鳅染色体组型比较[J].水生生物学报，2005，29（4）：469-472.
[4]王元军.南四湖泥鳅资源现状及开发[J].水利渔业，2005（04）：61-66.
[5]曾柳根，张伟，甘云飞，等.鄱阳湖泥鳅遗传多样性研究[J].水生生物学报，2010，34（5）：966-972.
[6]周玲玲，张桂蓉，魏开建，等.同域分布二倍体和四倍体泥鳅群体的遗传结构[J].华中农业大学学报，2011（05）：624-630.
[7]马纲.中国淡水鱼类染色体形态及其数目变异的研究进展[J].甘肃科学学报，1996，8（3）：77-80.
[8]王军萍，戴秀君，韩希福.河北省三种鳅科鱼类的染色体组型[J].河北大学学报（自然科学版），1993，13（3）：51-54.
[9]常重杰，余其兴.泥鳅Ag-NORs带和C带研究[J].河南师范大学学报（自然科学版），2000，28（2）：71-73.
[10]陈景星.中国花鳅亚科鱼类系统分类的研究[A]//鱼类学论文集（第一集）[C].北京：科学出版社，1981：21-32. （责编：张宏民）