【摘 要】
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目的 通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶,研究其安全性及溶栓功效.方法 采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株,利用基因工程技术将其AprE9912D基因在大
【机 构】
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四川省中医药科学院,防治重大疾病中药药效学评价平台,四川省中药质量评价重点实验室,四川成都610041
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目的 通过基因工程技术生产的豆豉血栓溶解酶,研究其安全性及溶栓功效.方法 采用酪蛋白平板从豆豉中分离获得具有纤溶活性的候选菌株,利用基因工程技术将其AprE9912D基因在大肠杆菌BL21(DE3)-pDEl中过表达AprE9912D重组蛋白.经过Ni-NTA纯化柱和透析纯化AprE9912D重组蛋白,体外采用纤维蛋白平板、溶解混合血栓考察溶栓作用,体内采用动静脉旁路血栓模型进行功效评价.同时对其安全性进行初步评估.结果 经过分子鉴定,筛选出具有纤溶酶活性的菌株是贝莱斯芽孢杆菌9912D(Bacillus velezensis 9912D).序列分析发现AprE9912D基因的开放阅读框有382个氨基酸,属于S8家族碱性丝氨酸蛋白,使用SWISS-MODEL同源预测AprE9912D蛋白3D模型.经过Ni-NTA柱纯化,AprE9912D纤溶酶蛋白相对分子质量约为36 000.体外测得AprE9912D纤溶酶酶活力为442.6 kU/mg,2.0 kU/mL AprE9912D纤溶酶就能有效溶解混合血栓,其溶解率为40.0％.在体内,4.0kU/kg能显著抑制动静脉旁路血栓形成,抑制率为32.9％.体外溶血显示AprE9912D纤溶酶93.0U/mL时,其溶血率为3.33％;测得小鼠静脉注射AprE9912D纤溶酶半数致死量(LD50)＞102.6 kU/kg.结论 AprE9912D纤溶酶具有活性较强、安全性较高的特点,具有进一步开发的广阔前景.
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