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摘要 [目的]采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）研究羊耳菊提取物在大鼠循环肠灌流液中的代谢产物。[方法]收集健康SD大鼠循环肠灌流液，分别用甲酸水溶液和正丁醇处理样品后，UHPLC-Q-TOF/MS分析其代谢产物。结合对照品、质谱碎片信息和相关文献，初步推测代谢产物的结构。[结果]大鼠循环肠灌流液中的代谢物较少，初步鉴定出3个代谢产物，主要存在二咖啡酰基奎宁酸酯基位置异构和甲基化代谢物。[结论]该方法初步探究了羊耳菊提取物主要成分在大鼠循环肠灌流液中的代谢特征，为阐释羊耳菊药材的药效物质基础提供理论依据。
关键词 羊耳菊；活性部位；肠灌流液；代谢产物
中图分类号 R927.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0122-03
Abstract [Objective]To investigated the metabolites of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats by UHPLCQTOF/MS.[Method]The healthy intestinal perfusion fluid of SD rats was collected and the samples were treated with formic acid aqueous solution and nbutanol respectively.Identification and structural elucidation of the metabolites were performed by comparing the changes in molecular masses，retention times and full scan metabolisms （MS） spectra with those of the parent drug，and the relative data of authentic reference.[Results] There were fewer metabolites in the intestinal circulating perfusion fluid of rats，and three metabolites were identified.There were mainly isomers and methylated metabolites of dicaffeoylquinic acid ester groups.[Conclusion]The method is used to study the metabolic characteristics of the main components of the extract of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats，and to provide the theoretical basis for elucidating the pharmacological basis of the herbs.
Key words Inula cappa；Active parts；Intestinal circulating perfusion fluid；Metabolites
羊耳菊为菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草，具有疏风散热、解毒消肿的功效，是贵州苗族常用药材，苗语药名为“Bex nioux dant”（近似汉译音为“白牛胆”），在《苗族医药学》《中华本草·苗药卷》、2003 版《贵州省中药、民族药质量标准》中均有收载[1-3]。在傣族，羊耳菊又名“纳罕” ，为傣医名方“雅叫哈顿散”（收载于 2010年版《中国药典》一部）的主药。 《中国民族药志》记载[4]：除苗族、傣族外，羊耳菊在我国壮、侗、景颇、拉祜、傈僳、苗、彝、佤等少数民族地区均有丰富的药用经验，常用于感冒发热、咽喉肿痛、风湿疼痛、痈疮疔毒、乳痈等症，有独特疗效。但羊耳菊基础研究薄弱一直是亟待解决的技术问题，特别是羊耳菊的药效物质基础一直未能明确，导致产品工艺和质量控制水平低，很难保证羊耳菊及其相关产品的质量和疗效[5]，并已成为制约羊耳菊产品升级换代和产业链做大做强的瓶颈。
药物代谢是指药物吸收和分布之后在血液或组织中的生物转化过程，生物转化的产物称为代谢产物。在实际工作中常见许多中药提取物在血中根本检测不到原型药物成分，但药效却是显而易见的，究其原因可能是代谢产物发挥了治疗作用[6]。因此，通过代谢研究，可以明确中药吸收进入体内的成分及其存在形式，進而阐明其代谢途径和机制，从而初步明确其药效物质。羊耳菊药材的临床研究相关报道较多，但鲜有针对其体内吸收代谢情况的研究报道。肠道不仅是药物吸收的必经主要部位，其存在的代谢酶和相关转运蛋白也同时参与药物的生物转化过程，因此药物在肠道循环过程，不仅存在吸收过程，还伴随着药物代谢。而在体肠灌流模型不仅是研究药物吸收的简单可行的研究方法，更能够应用于药物肠道代谢特征的研究，相较于各种体外代谢研究方法，更加直观和可靠[7-9]。因此该研究采用大鼠在体肠灌流模型研究羊耳菊活性部位在大鼠循环肠灌流液中的代谢产物，对其在肠道中可能的代谢物进行初步研究，以期为阐释羊耳菊药材的药效物质基础提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。木犀草苷、绿原酸对照品，批号分别为111720-201408、110753-201415，均购于中国食品药品检定研究院；新绿原酸、隐绿原酸、1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰基奎宁酸对照品，批号分别为X20-20141012、Y58-20141012、1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215，均购于中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；羊耳菊药材购自贵州龙里县，由贵州医科大学药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定为菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草。 1.1.2 仪器。超高压效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱仪（Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱系统，布鲁克道尔顿四极杆-飞行时间质谱仪）；Allegra 64R低温高速离心机（Beckman Coulter）；MTN-2800D氮吹仪（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）。
1.1.3 试验动物。健康SD大鼠，雌雄兼用，体重为（250±20） g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供[合格证号：SCXK （渝）2015-0001]。
1.2 方法
1.2.1 溶液的配制。
1.2.1.1 Krebs-Ringer’s （K-R）营养液的配制。
称取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.02 g、CaCl2 0.37 g、葡萄糖 1.40 g，用少量蒸馏水溶解，其中CaCl2单独溶解后逐滴加入，葡萄糖临用加入，溶解后用蒸馏水定容至1 L。
1.2.1.2 羊耳菊活性部位供试液的制备。
取羊耳菊药材12 kg，充分混匀，取10倍量60%乙醇，提取3次，每次1 h，合并3次滤液，减压浓缩，回收乙醇，得12 L浓缩液。上述浓缩液用D101大孔树脂吸附（径高比1∶4），加水洗脱至流出液无颜色后，再用60%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，得浸膏，微波真空干燥即得，得膏率为7 %，-4 ℃条件干燥保存，备用。经测定，羊耳菊提取物中木犀草苷、1，3-二咖啡酰基奎宁酸、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-二咖啡酰基奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量依次为0.74%、2.01%、3.82%、3.56%、3.87%、2.17%、0.99%、3.36%。
取适量提取物，加入适量的K-R营养液，超声10 min，5 000 r/min 离心10 min，取上清液備用，获得2.5、5.0、10.0 mg/mL 的供试液。
1.2.2 Q-TOF MS/MS质谱条件。
电喷雾离子源；扫描方式为负离子扫描（ESI-，m/z 50～1 000）；毛细管电压：ESI-（3.5 kV）、ESI+ （4kV）；离子源温度200 ℃；雾化气（N2）压力1.2 bar；干燥气温度200 ℃；气体体积流量6 L/min；准确质量测定采用甲酸钠校正标准液；校正模式选用Enhanced Quadratic；数据分析采用Data Analysis软件、Metabolite Tools、质量亏损过滤（MDF）等。
1.2.3 UHPLC色谱条件。
色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；进样体积为5 μL。梯度洗脱条件：0～1 min，5%～10 %A；1～13 min，10%～28%A；13～16 min，28%～100%A；16～17 min，100%A，17～18 min，100%～5%A。
1.2.4 灌流液样品处理。
取灌流液样品1 mL， 加入100 μL 1%的甲酸水溶液， 再加入500 μL正丁醇，涡旋混合5 min，萃取3次，合并正丁醇层萃取液，8 000 r/min 离心10 min，取上清液于37 ℃下N2吹干，残渣加1 mL正丁醇涡旋混合溶解后，10 000 r/min 离心10 min，取上清液37 ℃下N2吹干，残渣加200 μL 50 %甲醇水溶解，15 000 r/min 离心10 min，上清液进样UHPLC-Q-TOF/MS分析。
1.2.5 羊耳菊活性部位在大鼠循环肠灌流试验中灌流液的收集。
给药前大鼠禁食24 h，自由饮水。手术前腹腔注射30%乌拉坦（1.4 g/kg）麻醉，固定于恒温手术台，37 ℃保温，剃毛。沿腹中线腹腔开口3～4 cm，小心分离十二指肠，并结扎总胆管，再分离出试验肠段，上端切口插入小硅胶管，缝合固定，连接恒流泵，下端切口插入硅胶管，固定，与恒流泵形成回路。灌流前，用37 ℃的生理盐水以1.0 mL/min 的流速，冲洗肠道至净，然后排空水分。取37 ℃羊耳菊灌流液50 mL，先以5 mL/min 流速循环平衡15 min 后，将流速调节为 2.5 mL/min，立即读出循环液体积并自循环液量筒中取样1 mL，作为零时间药物浓度的样品，另向量筒中补加K-R 缓冲液1 mL，于3 h时同法取灌流液，并结束试验。试验开始前收集一次空白灌流液，并收集在体循环灌流试验结束时3 h的灌流液样品，备用。
1.2.6 灌流液样品中的代谢产物鉴定。采用UHPLC-Q-TOF/MS法检测，并运用Bruker公司的Data Analysis软件，得到生物样品的总离子流图，二级质谱图，再结合Metabolite Predict软件预测的羊耳菊活性部位中多个有效成分的可能代谢产物，并将生成的Masslist导入Metabolite Detect软件中，推测出其可能的代谢产物。
2 结果与分析
由Metabolite Detect得到空白灌流液、灌流液样品及差异图谱见图1，灌流液中共检测到3个代谢产物（表1），鉴定结果如下。
（1）M1。在5.8 min处存在m/z 543.127 2[M-H]-的准分子离子峰，比二咖啡酰基奎宁酸多C2H4，裂解后，产生的m/z 367.103 2碎片离子比单咖啡酰基奎宁酸多CH2，同时m/z 193.055 9碎片离子比咖啡酸负离子多CH2，故初步推断M1可能是二咖啡酰基奎宁酸的双甲基化产物。 （2）M2和M3。保留時间分别为9.2和9.4 min的准分子离子峰分别为m/z 515.119 2[M-H]-、515.120 2[M-H]-，它们均产生m/z 353.087 0和m/z 353.088 3的碎片离子，与3，4-二咖啡酰基奎宁酸和3，5-二咖啡酰基奎宁酸的分子式和质谱碎片相似，但保留时间不一致，通过与对照品对比，M2和M3可能为二咖啡酰基奎宁酸在大鼠体内发生酯基位置异构而产生的。
3 讨论
该研究建立UHPLC-Q-TOF/MS对灌流液中的羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代谢产物检测方法，其具有离子传输效率高、传输离子质量范围宽、灵敏度高、错误率低、重现性高等优点，并结合超高压液相（UHPLC）的高灵敏度和基
线稳定性为研究带来了优良的分析能力。试验中18 min即可完成对复杂生物样品的检测，该方法可对检测样品色谱信
息进行全采集，且各色谱峰分离较好，为后期分析处理海量的代谢数据奠定基础。此外，样品检测时选用甲酸钠溶液为高分辨质谱质量准确度校正标准液。批量液质联用分析时，可每个样品进行单独校正，以消除仪器长时间运行时造成数据波动，确保数据准确性。在每个样品的数据中，都有标准品进入质谱，可运用DataAnalysis Version 4.0软件中选择相对应的标准品列表与校正模式，对数据进行自动匹配并校正。
在药物体内外代谢研究中，对代谢产物数据的分析处理是重点也是难点。因此，该研究运用布鲁克公司研发的数据处理工具Metabolite Tools TM对代谢信息进行分析。其中包含Metabolite Predict和Metabolite Detect 这2个相关软件，首先根据药物中原型成分的结构特征及其在体内可能发生的代谢变化，选择相应的代谢途径，由Metabolite Predict软件预测出庞大的代谢产物Masslist；将Masslist导入至MetaboliteDetect中，与差异图谱进行匹配，通过差异分析对可能的代谢产物进行定性分析。该研究中发现羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代谢产物较少，主要存在二咖啡酰基奎宁酸酯基位置异构和甲基化代谢物，为阐释羊耳菊药材的药效物质基础提供理论依据。
参考文献
[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草·苗药卷[M].贵阳：贵州科技出版社，2005：273-274.
[2] 贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[M].贵阳：贵州科技出版社，2003：176.
[3] 贵州省中医研究所.苗族医药学[M].贵阳： 贵州民族出版社，1992：506.
[4] 《中国民族药志》编委会，中国民族药志[M].成都：四川民族出版社，2007：257-258.
[5]姚波，杨树德，梁晓原.羊耳菊的生药学研究[J].云南中医中药杂志 ，2010，31（9）：39-41.
[6] 罗芬，池玉梅，吴皓.中药代谢动力学研究概述[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（14）： 284-288.
[7] ZHAI L X，SHI J，XU W T，et al.Ex Vivo and In Situ evaluation of ‘DispellingWind’ chinese medicine herb–drugs on intestinal absorption of chlorogenic Acid[J].Phytotherapy research，2015，29：1974-1981.
[8] HE R，XU Y S，PENG J J，et al.The effects of 18β-glycyrrhetinic acid and glycyrrhizin on intestinal absorption of paeoniflorin using the everted rat gut sac model[J].Journal of natural medicines，2017，71（1）：198-207.
[9] WANG J，CAO G X，WANG H，et al.Characterization of isochlorogenic acid A metabolites in rats using high-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J].Biomedical chromatography，2017，31（8）：1-10.
关键词 羊耳菊；活性部位；肠灌流液；代谢产物
中图分类号 R927.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）28-0122-03
Abstract [Objective]To investigated the metabolites of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats by UHPLCQTOF/MS.[Method]The healthy intestinal perfusion fluid of SD rats was collected and the samples were treated with formic acid aqueous solution and nbutanol respectively.Identification and structural elucidation of the metabolites were performed by comparing the changes in molecular masses，retention times and full scan metabolisms （MS） spectra with those of the parent drug，and the relative data of authentic reference.[Results] There were fewer metabolites in the intestinal circulating perfusion fluid of rats，and three metabolites were identified.There were mainly isomers and methylated metabolites of dicaffeoylquinic acid ester groups.[Conclusion]The method is used to study the metabolic characteristics of the main components of the extract of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats，and to provide the theoretical basis for elucidating the pharmacological basis of the herbs.
Key words Inula cappa；Active parts；Intestinal circulating perfusion fluid；Metabolites
羊耳菊为菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草，具有疏风散热、解毒消肿的功效，是贵州苗族常用药材，苗语药名为“Bex nioux dant”（近似汉译音为“白牛胆”），在《苗族医药学》《中华本草·苗药卷》、2003 版《贵州省中药、民族药质量标准》中均有收载[1-3]。在傣族，羊耳菊又名“纳罕” ，为傣医名方“雅叫哈顿散”（收载于 2010年版《中国药典》一部）的主药。 《中国民族药志》记载[4]：除苗族、傣族外，羊耳菊在我国壮、侗、景颇、拉祜、傈僳、苗、彝、佤等少数民族地区均有丰富的药用经验，常用于感冒发热、咽喉肿痛、风湿疼痛、痈疮疔毒、乳痈等症，有独特疗效。但羊耳菊基础研究薄弱一直是亟待解决的技术问题，特别是羊耳菊的药效物质基础一直未能明确，导致产品工艺和质量控制水平低，很难保证羊耳菊及其相关产品的质量和疗效[5]，并已成为制约羊耳菊产品升级换代和产业链做大做强的瓶颈。
药物代谢是指药物吸收和分布之后在血液或组织中的生物转化过程，生物转化的产物称为代谢产物。在实际工作中常见许多中药提取物在血中根本检测不到原型药物成分，但药效却是显而易见的，究其原因可能是代谢产物发挥了治疗作用[6]。因此，通过代谢研究，可以明确中药吸收进入体内的成分及其存在形式，進而阐明其代谢途径和机制，从而初步明确其药效物质。羊耳菊药材的临床研究相关报道较多，但鲜有针对其体内吸收代谢情况的研究报道。肠道不仅是药物吸收的必经主要部位，其存在的代谢酶和相关转运蛋白也同时参与药物的生物转化过程，因此药物在肠道循环过程，不仅存在吸收过程，还伴随着药物代谢。而在体肠灌流模型不仅是研究药物吸收的简单可行的研究方法，更能够应用于药物肠道代谢特征的研究，相较于各种体外代谢研究方法，更加直观和可靠[7-9]。因此该研究采用大鼠在体肠灌流模型研究羊耳菊活性部位在大鼠循环肠灌流液中的代谢产物，对其在肠道中可能的代谢物进行初步研究，以期为阐释羊耳菊药材的药效物质基础提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试材。木犀草苷、绿原酸对照品，批号分别为111720-201408、110753-201415，均购于中国食品药品检定研究院；新绿原酸、隐绿原酸、1，3-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，4-O-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-O-二咖啡酰基奎宁酸和4，5-二-O-咖啡酰基奎宁酸对照品，批号分别为X20-20141012、Y58-20141012、1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215，均购于中药固体制剂制造技术国家工程研究中心；羊耳菊药材购自贵州龙里县，由贵州医科大学药学院生药学教研室龙庆德副教授鉴定为菊科植物羊耳菊[Inula cappa（Buch.-Ham.ex D.Don）DC.]的干燥全草。 1.1.2 仪器。超高压效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱仪（Agilent Technologies 1290 Infinity液相色谱系统，布鲁克道尔顿四极杆-飞行时间质谱仪）；Allegra 64R低温高速离心机（Beckman Coulter）；MTN-2800D氮吹仪（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）。
1.1.3 试验动物。健康SD大鼠，雌雄兼用，体重为（250±20） g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供[合格证号：SCXK （渝）2015-0001]。
1.2 方法
1.2.1 溶液的配制。
1.2.1.1 Krebs-Ringer’s （K-R）营养液的配制。
称取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.02 g、CaCl2 0.37 g、葡萄糖 1.40 g，用少量蒸馏水溶解，其中CaCl2单独溶解后逐滴加入，葡萄糖临用加入，溶解后用蒸馏水定容至1 L。
1.2.1.2 羊耳菊活性部位供试液的制备。
取羊耳菊药材12 kg，充分混匀，取10倍量60%乙醇，提取3次，每次1 h，合并3次滤液，减压浓缩，回收乙醇，得12 L浓缩液。上述浓缩液用D101大孔树脂吸附（径高比1∶4），加水洗脱至流出液无颜色后，再用60%乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，得浸膏，微波真空干燥即得，得膏率为7 %，-4 ℃条件干燥保存，备用。经测定，羊耳菊提取物中木犀草苷、1，3-二咖啡酰基奎宁酸、3，4-二咖啡酰基奎宁酸、3，5-二咖啡酰基奎宁酸、4，5-二咖啡酰基奎宁酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸的含量依次为0.74%、2.01%、3.82%、3.56%、3.87%、2.17%、0.99%、3.36%。
取适量提取物，加入适量的K-R营养液，超声10 min，5 000 r/min 离心10 min，取上清液備用，获得2.5、5.0、10.0 mg/mL 的供试液。
1.2.2 Q-TOF MS/MS质谱条件。
电喷雾离子源；扫描方式为负离子扫描（ESI-，m/z 50～1 000）；毛细管电压：ESI-（3.5 kV）、ESI+ （4kV）；离子源温度200 ℃；雾化气（N2）压力1.2 bar；干燥气温度200 ℃；气体体积流量6 L/min；准确质量测定采用甲酸钠校正标准液；校正模式选用Enhanced Quadratic；数据分析采用Data Analysis软件、Metabolite Tools、质量亏损过滤（MDF）等。
1.2.3 UHPLC色谱条件。
色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温40 ℃；流动相为0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）；进样体积为5 μL。梯度洗脱条件：0～1 min，5%～10 %A；1～13 min，10%～28%A；13～16 min，28%～100%A；16～17 min，100%A，17～18 min，100%～5%A。
1.2.4 灌流液样品处理。
取灌流液样品1 mL， 加入100 μL 1%的甲酸水溶液， 再加入500 μL正丁醇，涡旋混合5 min，萃取3次，合并正丁醇层萃取液，8 000 r/min 离心10 min，取上清液于37 ℃下N2吹干，残渣加1 mL正丁醇涡旋混合溶解后，10 000 r/min 离心10 min，取上清液37 ℃下N2吹干，残渣加200 μL 50 %甲醇水溶解，15 000 r/min 离心10 min，上清液进样UHPLC-Q-TOF/MS分析。
1.2.5 羊耳菊活性部位在大鼠循环肠灌流试验中灌流液的收集。
给药前大鼠禁食24 h，自由饮水。手术前腹腔注射30%乌拉坦（1.4 g/kg）麻醉，固定于恒温手术台，37 ℃保温，剃毛。沿腹中线腹腔开口3～4 cm，小心分离十二指肠，并结扎总胆管，再分离出试验肠段，上端切口插入小硅胶管，缝合固定，连接恒流泵，下端切口插入硅胶管，固定，与恒流泵形成回路。灌流前，用37 ℃的生理盐水以1.0 mL/min 的流速，冲洗肠道至净，然后排空水分。取37 ℃羊耳菊灌流液50 mL，先以5 mL/min 流速循环平衡15 min 后，将流速调节为 2.5 mL/min，立即读出循环液体积并自循环液量筒中取样1 mL，作为零时间药物浓度的样品，另向量筒中补加K-R 缓冲液1 mL，于3 h时同法取灌流液，并结束试验。试验开始前收集一次空白灌流液，并收集在体循环灌流试验结束时3 h的灌流液样品，备用。
1.2.6 灌流液样品中的代谢产物鉴定。采用UHPLC-Q-TOF/MS法检测，并运用Bruker公司的Data Analysis软件，得到生物样品的总离子流图，二级质谱图，再结合Metabolite Predict软件预测的羊耳菊活性部位中多个有效成分的可能代谢产物，并将生成的Masslist导入Metabolite Detect软件中，推测出其可能的代谢产物。
2 结果与分析
由Metabolite Detect得到空白灌流液、灌流液样品及差异图谱见图1，灌流液中共检测到3个代谢产物（表1），鉴定结果如下。
（1）M1。在5.8 min处存在m/z 543.127 2[M-H]-的准分子离子峰，比二咖啡酰基奎宁酸多C2H4，裂解后，产生的m/z 367.103 2碎片离子比单咖啡酰基奎宁酸多CH2，同时m/z 193.055 9碎片离子比咖啡酸负离子多CH2，故初步推断M1可能是二咖啡酰基奎宁酸的双甲基化产物。 （2）M2和M3。保留時间分别为9.2和9.4 min的准分子离子峰分别为m/z 515.119 2[M-H]-、515.120 2[M-H]-，它们均产生m/z 353.087 0和m/z 353.088 3的碎片离子，与3，4-二咖啡酰基奎宁酸和3，5-二咖啡酰基奎宁酸的分子式和质谱碎片相似，但保留时间不一致，通过与对照品对比，M2和M3可能为二咖啡酰基奎宁酸在大鼠体内发生酯基位置异构而产生的。
3 讨论
该研究建立UHPLC-Q-TOF/MS对灌流液中的羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代谢产物检测方法，其具有离子传输效率高、传输离子质量范围宽、灵敏度高、错误率低、重现性高等优点，并结合超高压液相（UHPLC）的高灵敏度和基
线稳定性为研究带来了优良的分析能力。试验中18 min即可完成对复杂生物样品的检测，该方法可对检测样品色谱信
息进行全采集，且各色谱峰分离较好，为后期分析处理海量的代谢数据奠定基础。此外，样品检测时选用甲酸钠溶液为高分辨质谱质量准确度校正标准液。批量液质联用分析时，可每个样品进行单独校正，以消除仪器长时间运行时造成数据波动，确保数据准确性。在每个样品的数据中，都有标准品进入质谱，可运用DataAnalysis Version 4.0软件中选择相对应的标准品列表与校正模式，对数据进行自动匹配并校正。
在药物体内外代谢研究中，对代谢产物数据的分析处理是重点也是难点。因此，该研究运用布鲁克公司研发的数据处理工具Metabolite Tools TM对代谢信息进行分析。其中包含Metabolite Predict和Metabolite Detect 这2个相关软件，首先根据药物中原型成分的结构特征及其在体内可能发生的代谢变化，选择相应的代谢途径，由Metabolite Predict软件预测出庞大的代谢产物Masslist；将Masslist导入至MetaboliteDetect中，与差异图谱进行匹配，通过差异分析对可能的代谢产物进行定性分析。该研究中发现羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代谢产物较少，主要存在二咖啡酰基奎宁酸酯基位置异构和甲基化代谢物，为阐释羊耳菊药材的药效物质基础提供理论依据。
参考文献
[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草·苗药卷[M].贵阳：贵州科技出版社，2005：273-274.
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