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【摘 要】目的：观察敏感剂量下吡柔比星（Pirarubicin，THP）对体外培养人横纹肌肉瘤RD细胞细胞周期及β-catenin表达的影响。方法：应用不同浓度吡柔比星（0，0.01，1.0μg/mL）分别作用人横纹肌肉瘤RD细胞株24h；倒置相差显微镜下观察RD细胞株的形态学改变及流式细胞实验检测细胞周期情况；免疫印迹实验检测细胞蛋白β-catenin表达变化情况。结果：（1）吡柔比星（THP）处理RD细胞24h后，RD细胞皱缩，体积变小，外形更趋向于球状。（2）用吡柔比星（THP）处理RD细胞24h后，细胞呈G2期阻滞。（3）免疫印迹实验检测示随着药物浓度的增高β-catenin的水平逐渐减少。结论：吡柔比星可以诱导RD细胞凋亡，其机制可能与下调β-catenin蛋白表达有关。
【关键词】吡柔比星；横纹肌肉瘤；细胞周期；β-catenin
【文章编号】1004-7484（2014）07-4278-01
横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma， RMS）是儿童期最常见的一种软组织肉瘤，约占儿童期软组织肉瘤的50%～60%。来源于横纹肌细胞或向横纹肌细胞分化的间叶细胞，分化程度较低，恶性程度较高，易有局部浸润和血行、淋巴道转移，预后差[1]。近年来研究吡柔比星对泌尿系统肿瘤较多，而吡柔比星对横纹肌肉瘤的报道较少。吡柔比星（THP）具有较广的抗癌谱，对多种肿瘤细胞株具有抗癌活性，吡柔比星对横纹肌肉瘤细胞增殖及凋亡的影响尚未见报道。本研究通过观察常规化疗药物THP对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖及凋亡的影响，为吡柔比星（THP）对横纹肌肉瘤的治疗提供更多证据支持。
1 材料和方法
1.1实验材料和仪器 人横纹肌肉瘤RD细胞株购自上海中科院细胞库；RPMI 1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；β-catenin一抗购自美国Santa Cruz公司；细胞周期试剂盒购自上海碧云天公司。
1.2方法
1.2.1 细胞培养 人横纹肌肉瘤RD细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃，5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 实验分组 前期试验工作已经筛选了THP最佳药物浓度为：1.00μg/mL。THP药物浓度分别为0μg/mL（对照组）、0.01 μg/mL，1.00 μg/mL三组。
1.2.3 细胞形态实验 选取处于对数生长期RD细胞，在无菌条件下接种到放置盖玻片12孔板中，每孔5×104个细胞，培养24h；加入一定药物浓度的RPMI 1640培养基培养24h，然后用预冷的4%多聚甲醛室温固定10min，用PBS洗3次，每次5min；用PBS洗涤3次，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）染核5min；用90%甘油的PBS封片，将多余的甘油用滤纸吸净后用指甲油固定片子；荧光显微镜下进行观察，拍摄结果。
1.2.4 细胞周期实验 收集对数生长期的RD细胞，调整细胞悬液浓度为1×106/ml；接种于六孔板，每孔2ml，贴壁，处理48h后收获细胞，PBS洗两遍并离心（1000rpm、5min），加入500μl Binding Buffer悬浮细胞，再加5μl Annexin-V-FITC混匀后，加入5μl PI，室温，避光，染色15min后，1 h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。本实验重复3次。
1.2.5 免疫印迹实验 收集各药物处理组及对照组的细胞，RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA试剂盒测蛋白浓度。12%SDS-PAGE电泳，恒流转膜，分别加入β-catenin一抗（1：2000），一抗封闭于4℃过夜，室温孵育2h，TBST洗膜后加入HRP标记的羊抗兔二抗（1：6000），室温1h，TBST/PBS洗膜，化学法曝光显影，冲洗胶片。分析条带灰度值，以各样本目的蛋白/β-actin的比值表示目的蛋白表达量。
1.2.6 统计学处理 计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。各组间均数的比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用S-N-K检验，P<0.05为差异有显著性。
3讨论
Wnt/β-catenin信号通路广泛参与调节细胞的增殖和凋亡等病理生理过程，其不当激活与肿瘤的发生有密切关系。研究表明一些促肿瘤生长信号使β-catenin逃脱降解，在细胞浆内大量积聚并进入细胞核，引起下游靶基因的活化或失活，进而引起细胞的过度增殖和恶性转化。总之是Wnt/β-catenin信号通路的关键枢纽分子，参与了肿瘤增殖的调控，在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中可见该信号通路的异常，Annavarapu等研究表明横纹肌肉瘤中亦可见该信号通路的异常表达。
THP作为一种新一代半合成蒽环类抗肿瘤化疗药物，其特点是抗癌活性高、抗癌谱广且毒副作用低。目前，吡柔比星广泛应用于膀胱癌的治疗，与丝裂霉素比较其达到有效药物浓度的作用时间短[2]。国内外研究证实，其用于胃癌新辅助化疗效果较好[3]，但是针对横纹肌肉瘤的研究比较少。本研究证实吡柔比星可诱导RD细胞凋亡，其抑制作用呈浓度及时间依赖性；吡柔比星对RD细胞中的β-catenin蛋白表达有明显下调作用，且药物浓度越大对β-catenin表达下调作用越明显。
分析本实验结果表明吡柔比星诱导RD细胞的凋亡作用可能与下调β-catenin蛋白表达有关。
参考文献
[1] 仇宇， 杜言凯， 张川， 等. 比较雷帕霉素和吡柔比星抑制膀胱癌T24细胞生长活性的实验研究. 现代泌尿外科杂志， 2012；17（2）：141-145.
[2] 陈涤平，张宇.三种不同化疗药物膀胱灌注预防浅表性膀胱癌术后复发的疗效比较[J].现代泌尿外科杂志。2008，13（2）：121-123.
[3] 王晓光， 傅军， 郑航， 等. 吡柔比星与温热协同对胃癌细胞增殖和侵袭的抑制作用. 解放军医学杂志， 2006； 31（06）：564-566.
【关键词】吡柔比星；横纹肌肉瘤；细胞周期；β-catenin
【文章编号】1004-7484（2014）07-4278-01
横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma， RMS）是儿童期最常见的一种软组织肉瘤，约占儿童期软组织肉瘤的50%～60%。来源于横纹肌细胞或向横纹肌细胞分化的间叶细胞，分化程度较低，恶性程度较高，易有局部浸润和血行、淋巴道转移，预后差[1]。近年来研究吡柔比星对泌尿系统肿瘤较多，而吡柔比星对横纹肌肉瘤的报道较少。吡柔比星（THP）具有较广的抗癌谱，对多种肿瘤细胞株具有抗癌活性，吡柔比星对横纹肌肉瘤细胞增殖及凋亡的影响尚未见报道。本研究通过观察常规化疗药物THP对人横纹肌肉瘤RD细胞增殖及凋亡的影响，为吡柔比星（THP）对横纹肌肉瘤的治疗提供更多证据支持。
1 材料和方法
1.1实验材料和仪器 人横纹肌肉瘤RD细胞株购自上海中科院细胞库；RPMI 1640培养液购自杭州吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；β-catenin一抗购自美国Santa Cruz公司；细胞周期试剂盒购自上海碧云天公司。
1.2方法
1.2.1 细胞培养 人横纹肌肉瘤RD细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃，5%CO2，饱和湿度的恒温培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 实验分组 前期试验工作已经筛选了THP最佳药物浓度为：1.00μg/mL。THP药物浓度分别为0μg/mL（对照组）、0.01 μg/mL，1.00 μg/mL三组。
1.2.3 细胞形态实验 选取处于对数生长期RD细胞，在无菌条件下接种到放置盖玻片12孔板中，每孔5×104个细胞，培养24h；加入一定药物浓度的RPMI 1640培养基培养24h，然后用预冷的4%多聚甲醛室温固定10min，用PBS洗3次，每次5min；用PBS洗涤3次，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI）染核5min；用90%甘油的PBS封片，将多余的甘油用滤纸吸净后用指甲油固定片子；荧光显微镜下进行观察，拍摄结果。
1.2.4 细胞周期实验 收集对数生长期的RD细胞，调整细胞悬液浓度为1×106/ml；接种于六孔板，每孔2ml，贴壁，处理48h后收获细胞，PBS洗两遍并离心（1000rpm、5min），加入500μl Binding Buffer悬浮细胞，再加5μl Annexin-V-FITC混匀后，加入5μl PI，室温，避光，染色15min后，1 h内用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。本实验重复3次。
1.2.5 免疫印迹实验 收集各药物处理组及对照组的细胞，RIPA裂解液裂解细胞提取总蛋白，BCA试剂盒测蛋白浓度。12%SDS-PAGE电泳，恒流转膜，分别加入β-catenin一抗（1：2000），一抗封闭于4℃过夜，室温孵育2h，TBST洗膜后加入HRP标记的羊抗兔二抗（1：6000），室温1h，TBST/PBS洗膜，化学法曝光显影，冲洗胶片。分析条带灰度值，以各样本目的蛋白/β-actin的比值表示目的蛋白表达量。
1.2.6 统计学处理 计量资料以均数±标准差（ ±s）表示，采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。各组间均数的比较采用单因素方差分析，各组间两两比较采用S-N-K检验，P<0.05为差异有显著性。
3讨论
Wnt/β-catenin信号通路广泛参与调节细胞的增殖和凋亡等病理生理过程，其不当激活与肿瘤的发生有密切关系。研究表明一些促肿瘤生长信号使β-catenin逃脱降解，在细胞浆内大量积聚并进入细胞核，引起下游靶基因的活化或失活，进而引起细胞的过度增殖和恶性转化。总之是Wnt/β-catenin信号通路的关键枢纽分子，参与了肿瘤增殖的调控，在肝癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤中可见该信号通路的异常，Annavarapu等研究表明横纹肌肉瘤中亦可见该信号通路的异常表达。
THP作为一种新一代半合成蒽环类抗肿瘤化疗药物，其特点是抗癌活性高、抗癌谱广且毒副作用低。目前，吡柔比星广泛应用于膀胱癌的治疗，与丝裂霉素比较其达到有效药物浓度的作用时间短[2]。国内外研究证实，其用于胃癌新辅助化疗效果较好[3]，但是针对横纹肌肉瘤的研究比较少。本研究证实吡柔比星可诱导RD细胞凋亡，其抑制作用呈浓度及时间依赖性；吡柔比星对RD细胞中的β-catenin蛋白表达有明显下调作用，且药物浓度越大对β-catenin表达下调作用越明显。
分析本实验结果表明吡柔比星诱导RD细胞的凋亡作用可能与下调β-catenin蛋白表达有关。
参考文献
[1] 仇宇， 杜言凯， 张川， 等. 比较雷帕霉素和吡柔比星抑制膀胱癌T24细胞生长活性的实验研究. 现代泌尿外科杂志， 2012；17（2）：141-145.
[2] 陈涤平，张宇.三种不同化疗药物膀胱灌注预防浅表性膀胱癌术后复发的疗效比较[J].现代泌尿外科杂志。2008，13（2）：121-123.
[3] 王晓光， 傅军， 郑航， 等. 吡柔比星与温热协同对胃癌细胞增殖和侵袭的抑制作用. 解放军医学杂志， 2006； 31（06）：564-566.