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摘要：【目的】克隆茶樹CsMAPKK3基因，并进行表达分析，为探究CsMAPKK3基因的生物学功能及其抗逆分子机制提供理论支持。【方法】以铁观音为材料，采用RT-PCR克隆其CsMAPKK3基因的全长cDNA序列，对其进行生物信息学分析，并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测其在不同组织及逆境胁迫下的表达情况。【结果】克隆获得的CsMAPKK3基因（GenBank登录号：AUD40506.1）cDNA序列全长1941 bp，包含完整开放阅读框（ORF），长度为1557 bp，编码518个氨基酸残基，蛋白相对分子量为57.52 kD，理论等电点（pI）为5.39，为无跨膜螺旋结构和信号肽的不稳定蛋白，含有多个磷酸化位点，定位于细胞质和细胞核中，属于PKc类型的MAPKK，且具有SPS1、S_TKc等催化结构域，以及D（I/L/V）K激活域和S/T-X3-5-S/T保守域，与中华猕猴桃PSS35243.1亲缘关系最近，且与拟南芥B亚家族聚为一类。CsMAPKK3基因起始密码子上游1714 bp的启动子区序列含有光响应、逆境响应、植物激素和厌氧诱导等相关的顺式作用元件。CsMAPKK3基因在根、茎、叶、花和果中均有表达，其中在茎和果的表达量较高，显著高于在花中的表达量（P<0.05），但与根和叶中的表达量均无显著差异（P>0.05）。低温胁迫抑制CsMAPKK3基因表达，而脱落酸（ABA）、高盐和干旱胁迫均能诱导CsMAPKK3基因上调表达。【结论】CsMAPKK3基因表达具有组织表达特异性，且参与茶树ABA、高盐、低温和干旱胁迫响应等逆境胁迫的分子调控。
关键词： 茶树;CsMAPKK3基因;基因克隆;生物信息学分析;表达分析;逆境胁迫
中图分类号： S571.103.53 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）03-0651-09
Cloning and expression analysis of CsMAPKK3 gene in tea plant
LU Jing-bing， YANG Run-mei， ZHANG Fei-yang， CAO Hong-li*
（College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in
Universities of Fujian Province， Fuzhou 350002， China）
Abstract：【Objective】The CsMAPKK3 gene of tea tree was cloned and its expression was analyzed to provide theoretical support for clarifying the biological function of tea plant CsMAPKK3 gene and revealing its role in tea plant’s stress resistance. 【Method】In this study，the full-length cDNA of MAPKK3 gene were cloned using RT-PCR from Tieguanyin tea plant. Then，the bioinformatics characteristics and functions of CsMAPKK3 gene were predicted，and its expression patterns in various tissues and under different stress treatments were investigated using real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full-length cDNA of CsMAPKK3 was 1941 bp，with a 1557 bp open reading frame（ORF），encoding 518 amino acids，and submitted to the GenBank with accession number of AUD40506.1. The molecular weight of CsMAPKK3 protein was 57.52 kD，and the theoretical isoelectric point（pI） was 5.39. The amino acid sequence prediction showed that it was an unstable protein without transmembrane helix structure and signal peptide，and contained multiple phosphorylation sites. CsMAPKK3 protein，located in cytoplasm and nucleus，belonged to PKC type MAPKK，and had catalytic domains such as SPS1，S_TKC，D（I/L/V）K activation domain and S/T-X3-5-S/T conserved domain. It had close relationship with Chinese kiwifruit（PSS35243.1），and was clustered in a class with Arabidopsis B subfamily in phylogenetic tree. Additionally，promoter sequence analysis showed that the 1714 bp promoter region in the initiation codon upstream of CsMAPKK3 contained several cis-acting elements related to light response，stress response，plant hormones，and anaerobic induction. Real time quantitative PCR analysis showed that CsMAPKK3 was expressed in roots，stems，leaves，flowers and fruits，and the expression level was higher in stems and fruits，which was significantly higher than that in flowers（P<0.05），but had no significant difference with that in roots and leaves（P>0.05）. The expression of CsMAPKK3 was down-regulated by cold stress，but up-regulated by abscisic acid（ABA），salt and drought treatments. 【Conclusion】The expression of CsMAPKK3 is tissue-specific，and it is involved in the tea plant response to ABA，high salt，low temperature and drought stresses. Key words： Camellia sinensis; CsMAPKK3 gene; gene cloning; bioinformatics analysis; expression analysis; stress
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31800587）; Education Research Project for Young and Middle-aged Teachers of Education Department of Fujian（JAT170160）
0 引言
【研究意义】在逆境胁迫下，植物可通过促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）级联途径响应，经过MAPKKK（MAPK kinase kinase）-MAPKK（MAPK kinase）-MAPK的依次磷酸化作用，将外界逆境信号级联放大并传递至下游，调控相应的生理生化反应（Hamel et al.，2006）。目前，国内外学者对MAPKs级联途径的研究越来越多，结果发现MAPKs级联途径在植物生长发育、抗病及非生物胁迫响应、植物激素信号转导通路和乙烯信号转导过程中均发挥重要作用（赵琳琳等，2008）。茶树喜好温暖湿润的生长环境，且偏好酸性土壤，低温、干旱和高盐等逆境条件下会导致茶树生长发育不良甚至死亡，对成茶品质产生严重影响。因此，研究茶树MAPKs级联途径相关基因对其抗逆境胁迫的分子机制研究及抗逆育种具有重要意义。【前人研究进展】MAPKK是双特异性蛋白酶，在MAPKs级联途径中，上游被激活的MAPKKK能磷酸化MAPKK中保守的S/T-X3-5-S/T（S为丝氨酸，T为苏氨酸，X为任意氨基酸）基序（Wu et al.，2014），从而激活MAPKK，然后MAPKK通过对MAPK活化环中T-X-Y（T为苏氨酸，Y为酪氨酸）基序的磷酸化而激活MAPK，最终通过激活的MAPK来激活下游应答因子将胞外逆境信号传递到细胞内进行响应。植物MAPKK在MAPKs级联途径中的成员数量最少。据报道，拟南芥基因组中至少存在60个AtMAPKKK基因和20个AtMAPK基因，但仅10个AtMAPKK基因被鉴定出（张振才等，2014）。根据S/T-X3-5-S/T保守结构和D激活位点，AtMAPKK基因家族可区分为A、B、C和D 4个亚族，其中AtMAPKK1、AtMAPKK2和AtMAPKK6属于A亚族，AtMAPKK3属于B亚族，AtMAPKK4和AtMAPKK5属于C亚族，AtMAPKK7、AtMAPKK8、AtMAPKK9和AtMAPKK10属于D亚族（Hamel et al.，2006）。此外，MAPKK是上游逆境信号的聚集点，也是下游MAPK的分支点，因此，对MAPKK功能的揭示是明确MAPKs级联反应途径作用机制的关键（Xu et al.，2010）。在逆境胁迫下，植物不同组织中的MAPKK基因表达量会发生上调或下调变化，然后通过MAPKs级联途径传导胁迫信号，最终通过激素调控、渗透调节、氧化还原和信号转导等对非生物胁迫作出应答。拟南芥AtMKK1基因参与多种拟南芥响应生物和非生物胁迫过程中的信號转导，包括对脱落酸（ABA）的响应调控（蔡国华等，2013）;将玉米ZmMKK1基因转入拟南芥中，可提高转基因植株的耐盐性和抗旱性（Cai et al.，2014）;棉花GhMKK3基因在响应干旱胁迫下被诱导上调表达，表明该基因参与干旱胁迫响应调控（Wang et al.，2016）。【本研究切入点】目前鲜见有关茶树MAPKK基因及MAPK信号通路在茶树抗逆过程中作用机制的研究报道。【拟解决的关键问题】克隆茶树CsMAPKK3基因cDNA全长序列，对其进行生物信息学分析，并检测该基因在外源ABA、盐胁迫、干旱胁迫和低温胁迫下的表达模式，并从茶树（舒茶早）基因组数据库中检索该基因的启动子序列，分析其顺式作用元件，为深入研究茶树MAPKK基因响应逆境胁迫中的分子机制和调控机理提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为3年生盆栽茶树品种铁观音的茶苗。多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自杭州开泰生物有限公司;Easy Script @One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒和Transstart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒购自厦门泰京生物技术有限公司。主要仪器设备：GeIDoc It TS3 Imager凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）、CFX96 Touch荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）、T100TM Thermal Cycler PCR仪（Bio-Rad，美国）、琼脂糖水平电泳仪和电泳槽（北京六一仪器有限公司）、AIRTECH紫外超净工作台（苏州安泰科技有限公司）和NanoDrop ND2000超微量分光光度计（Thermo Scientific，赛默飞世尔科技公司）。
1. 2 样品处理及采集
取供试材料的根、茎、叶、花和果实，每组织设3次生物学重复。参照曹红利等（2017）的方法对材料进行低温（4 ℃）、ABA（100 μmol/L ABA）、高盐（150 mmol/L NaCl）和干旱（100 g/L PEG）4种胁迫处理，分别在处理后3、9和24 h进行取样，以0 h为对照，每处理设3次生物学重复。所取样品经液氮速冻后放-80 ℃冰箱保存备用。
1. 3 总RNA提取及cDNA合成
根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，利用NanoDrop ND2000超微量分光光度计测定其浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，置于-80 ℃冰箱保存备用。按照Easy Script@One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明将所提取的总RNA反转录合成cDNA第一链，用于逆转录PCR（RT-PCR）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。 1. 4 基因克隆及启动子序列分析
根据本课题组前期试验获得的茶树低温转录组数据库中的基因注释，筛选出1个MAPKK3基因序列，将该参考序列在NCBI中进行比对后显示其含有完整的开放阅读框（ORF），因此设计ORF上、下游扩增引物（表1），按照PrimeSTAR HS试剂盒的说明配制50.0 μL体系进行PCR扩增。扩增程序：94 ℃预变性30 s，98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，共进行30个循环。PCR产物回收测序后与原序列拼接，最终获得该基因的cDNA序列。并根据cDNA序列在舒茶早茶树基因组数据库中检索，获得其密码子上游序列2000 bp的序列，最终得到1714 bp启动子序列。
1. 5 生物信息学分析
利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp对CsMAPKK3基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行同源性分析，并利用DNAMAN 6.0将CsMAPKK3与同源蛋白序列进行多重比对。使用ExPASy在线工具中的ProtParam预测CsMAPKK3蛋白的理化性质;使用SingalP 3.0预测其信号肽;利用TMHMM 2.0预测其跨膜螺旋结构域;采用NetPhos 3.1 Server预测其磷酸化位点;利用Plant-mPLoc和WOLF PSORT预测其亚细胞定位。将获得的CsMAPKK3基因启动子序列提交至PlantCARE中对其逆境相关顺式作用元件进行预测。利用MEGA 7.0的邻接法（Neighbor-joining method）构建系统发育进化树。
1. 6 qRT-PCR检测
通过qRT-PCR检测CsMAPKK3基因在茶树不同组织及4种胁迫处理下的表达情况，以CsPTB为内参基因，定量PCR引物见表1。参照Transstart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒说明配制反应体系（20.0 μL），包括2×TransTaq HiFiPCR SuperMix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性30 s;94 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s，共进行40个循环。采用2-ΔCt算法计算目的基因在组织中的相对表达量，2-ΔΔCt算法计算其在非生物胁迫下的相对表达量。
1. 7 统计分析
使用SPSS 22.0对数据采用LSD法和Dunnett法进行显著性分析（P<0.05），使用Excel 2020绘制柱形圖。
2 结果与分析
2. 1 CsMAPKK3基因克隆及序列分析结果
如图1所示，CsMAPKK3基因ORF的PCR产物约1500 bp，与预期结果相符，其测序结果显示，该序列为1557 bp，与参考序列拼接后，获得cDNA全长为1941 bp。CsMAPKK3基因编码518个氨基酸残基，且氨基酸序列中含有D（I/L/V）K激活域以及S/T-X3-5-S/T保守域（图2）。该基因序列已提交至GenBank，登录号为AUD40506.1。
2. 2 生物信息学分析结果
ProtParam预测结果显示，CsMAPKK3蛋白分子式为C2566H3996N682O768S26，相对分子量为57.52 kD，含酸性氨基酸（Asp+Glu）63个、碱性氨基酸（Arg+Lys）48个，理论等电点（pI）为5.39，不稳定系数为42.07，属于不稳定蛋白。TMHMM 2.0预测结果（图3）显示，CsMAPKK3蛋白无跨膜螺旋结构和信号肽。SignalP 3.0信号肽预测结果与TMHMM预测结果相同，即该蛋白无信号肽。
NetPhos 3.1 Server预测结果（图4）显示，CsMAPKK3蛋白含有52个能被磷酸化的位点（超过阈值线），其中包括27个Ser位点、16个Thr和9个Tyr位点，主要被unsp、cdc2、CKII和INSR等蛋白激酶磷酸化。Plant-mPLoc预测结果显示，CsMAPKK3蛋白定位于细胞核;WOLF PSORT预测结果显示，其定位于细胞质和细胞核（K值分别为11和2），故推测CsMAPKK3蛋白的亚细胞定位可能定位于细胞质和细胞核中。利用NCBI中BLASTp对CsMAPKK3蛋白功能结构域进行分析，结果（图5）发现，CsMAPKK3蛋白属于PKc类型的MAPKK，且具有SPS1、S_TKc等催化结构域。
用NCBI数据库中BLASTn对CsMAPKK3基因进行同源比对，结果显示该基因与葡萄（Vitis vini-fera）MAPKK3基因（GenBank登录号MT154083.1）的相似性最高，达85%，与栓皮栎（Quercus suber）MAPKK3基因（GenBank登录号XM_024032986.1）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）MAPKK3基因（GenBank登录号XM_021788394.1）的相似性均达84%。从NCBI数据库下载CsMAPKK3的同源蛋白氨基酸序列，并利用DNAMAN 6.0进行多重序列比对，结果（图6）显示，CsMAPKK3、拟南芥AtMKK3、玉米ZmMKK3和中华猕猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis）PSS35243.1序列中均含D（I/L/V）K激活域和S/T-X3-5-S/T保守域。以CsMAPKK3蛋白与拟南芥的10个AtMAPKK蛋白构建系统发育进化树，结果（图7）显示，CsMAPKK3蛋白与拟南芥B亚家族聚为一类，其中，与AtMKK3蛋白关系最近。以CsMAPKK3蛋白与其他17种植物的MAPKK蛋白构建系统发育进化树，结果（图8）表明，CsMAPKK3蛋白与中华猕猴桃PSS35243.1亲缘关系最近。 2. 3 CsMAPKK3基因启动子顺式作用元件分析结果
在PlantCARE中对茶树CsMAPKK3基因启动子序列进行顺式作用元件预测分析，结果（表2）显示，启动子区含有与光响应相关元件如ACE、ATCT-motif、Box 4、MRE和TCCC-motif等，以及多种逆境响应相关元件如TC-rich repeats等。此外，还含有与植物激素响应相关元件如脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element等，以及与厌氧诱导相关元件如ARE等。
2. 4 CsMAPKK3基因在不同组织及逆境胁迫处理下表达模式分析结果
CsMAPKK3基因在根、茎、叶、花和果中均有表达，其中在茎和果的表达量较高，显著高于花中的表达量，但与根和叶中的表达量均无显著差异（P>0.05）（图9-A）。CsMAPKK3基因在4种逆境胁迫处理（ABA、高盐、低温和干旱）下的表达量检测结果如图9-B～图9-E所示。ABA处理后CsMAPKK3基因较处理0时显著上调表达（P<0.05，下同），在9 h时达最大值（图9-B）;高盐胁迫处理也能显著诱导CsMAPKK3基因显著上调表达，在3 h时达最大值（图9-C）;低温胁迫处理下CsMAPKK3基因的表达模式与其他3个处理完全相反，其表达量呈显著下调趋势，在24 h时达最小值（图9-D）;干旱胁迫处理下CsMAPKK3基因的表达量与ABA处理呈相似的变化趋势，在9 h时显著上调表达，表达量达最大值（图9-E）。推测CsMAPKK3基因参与茶树ABA、高盐、低温和干旱胁迫响应调控。
3 讨论
自Ichimura等（1998）首次从模式植物拟南芥中鉴定出1条完整的MAPKs级联途径AtMEKK1-AtMKK1-AtMPK4，并证明其能传递干旱和机械损伤信号后，Teige等（2004）也在拟南芥中发现另一条MAPKs级联途径AtMEKK1-AtMAPKK2-AtMAPK4/AtMAPK6，并证实其参与抵御盐胁迫和低温胁迫;Schrnidt等（2013）研究发现MAPKs级联途径OsMEKK6-OsMAPK5参与水稻根部对盐胁迫的信号转导。可见，MAPKs级联途径在响应非生物胁迫中发挥重要作用，而MAPKK作为连接上游MAPKKK和下游MAPK的信号枢纽，是MAPKs级联途径中的关键点（单鸿轩和付畅，2017）。本研究克隆获得CsMAPKK3基因，并进行组织表达特性及非生物胁迫下表达模式分析，以期为研究MAPKs级联途径在茶树中的抗逆作用机制提供参考。CsMAPKK3亚细胞定位结果显示其可能定位于细胞质和细胞核中，与玉米ZmMKK3蛋白定位在细胞质和细胞核中的预测结果一致（Zhang et al.，2012）。而在此前与MAPKK定位相关的研究中，发现大多MAPKK蛋白定位于细胞质（Song et al.，2015），但也有定位于细胞核（Song et al.，2015）的报道，可能是由于MAPKK在细胞质中被上游MAPKKK激活，随后转移至细胞核磷酸化其下游的MAPK所导致。
本研究发现，CsMAPKK3基因启动子序列中含有与响应ABA胁迫和水杨酸等激素信号分子相关的多种顺式作用元件，推测该基因参与激素信号分子调控，从而影响植物生长发育。且通过qRT-PCR检测发现，CsMAPKK3基因在茶树茎和果中的表达量较高，与黄瓜CsMAPK4-2基因在果实中表达量最高，其旁系同源基因CsMAPK4-1在茎中的表达量较高的结果相似（Wang et al.，2015）;CsMAPKK3基因受高盐和干旱胁迫诱导表达显著上调，推测该基因可能参与茶树耐盐和抗旱响应。李粲等（2012）克隆获得甘蔗SoMAPK4基因，并证实该基因可能参与多种生物和非生物胁迫响应的信号传导。Song等（2015）研究发现，西瓜ClMKK3基因受非生物（干旱、高盐、高温和ABA）胁迫不同程度诱导上调表达，但低温胁迫抑制其显著下调表达，表明该基因在逆境胁迫中发挥重要调控功能;ClMKK5基因在西瓜枯萎菌侵染后第9 d时的表达量是对照的6倍，表明该基因在西瓜抗枯萎病过程中发挥重要调控功能（Song et al.，2015）。张演义等（2015）对葡萄MAPKK基因家族进行鉴定分析，结果发现MAPKK基因家族对植物生长发育细胞周期调控以及响应环境胁迫方面有重要作用。
基于前人对植物抗旱耐盐基因的研究结果，发现这些基因主要包括渗透调节基因、蛋白类基因（如信号传导中的蛋白激酶基因）及转录因子基因（陈丽萍和何道一，2010）。CsMAPKK3基因则属于蛋白类基因。蛋白磷酸化及去磷酸化过程在细胞的信号识别和转导中发挥重要作用，而细胞信号识别和转导又直接影响植物体对环境变化的感应和对逆境信息的传递，故在这个过程中蛋白激酶发挥重要的作用。通过蛋白质组学研究发现，在逆境條件下许多与逆境相关的蛋白表达量会发生明显变化（付晨熙等，2016）。因此，后续应重点研究CsMAPKK3蛋白在逆境中的调控机制及CsMAPKK3基因在MAPKs级联途径中的作用分子机制。
4 结论
CsMAPKK3基因表达具有组织表达特异性，且参与茶树ABA、高盐、低温和干旱胁迫响应等逆境胁迫的分子调控。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 茶树;CsMAPKK3基因;基因克隆;生物信息学分析;表达分析;逆境胁迫
中图分类号： S571.103.53 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）03-0651-09
Cloning and expression analysis of CsMAPKK3 gene in tea plant
LU Jing-bing， YANG Run-mei， ZHANG Fei-yang， CAO Hong-li*
（College of Horticulture，Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science in
Universities of Fujian Province， Fuzhou 350002， China）
Abstract：【Objective】The CsMAPKK3 gene of tea tree was cloned and its expression was analyzed to provide theoretical support for clarifying the biological function of tea plant CsMAPKK3 gene and revealing its role in tea plant’s stress resistance. 【Method】In this study，the full-length cDNA of MAPKK3 gene were cloned using RT-PCR from Tieguanyin tea plant. Then，the bioinformatics characteristics and functions of CsMAPKK3 gene were predicted，and its expression patterns in various tissues and under different stress treatments were investigated using real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】The full-length cDNA of CsMAPKK3 was 1941 bp，with a 1557 bp open reading frame（ORF），encoding 518 amino acids，and submitted to the GenBank with accession number of AUD40506.1. The molecular weight of CsMAPKK3 protein was 57.52 kD，and the theoretical isoelectric point（pI） was 5.39. The amino acid sequence prediction showed that it was an unstable protein without transmembrane helix structure and signal peptide，and contained multiple phosphorylation sites. CsMAPKK3 protein，located in cytoplasm and nucleus，belonged to PKC type MAPKK，and had catalytic domains such as SPS1，S_TKC，D（I/L/V）K activation domain and S/T-X3-5-S/T conserved domain. It had close relationship with Chinese kiwifruit（PSS35243.1），and was clustered in a class with Arabidopsis B subfamily in phylogenetic tree. Additionally，promoter sequence analysis showed that the 1714 bp promoter region in the initiation codon upstream of CsMAPKK3 contained several cis-acting elements related to light response，stress response，plant hormones，and anaerobic induction. Real time quantitative PCR analysis showed that CsMAPKK3 was expressed in roots，stems，leaves，flowers and fruits，and the expression level was higher in stems and fruits，which was significantly higher than that in flowers（P<0.05），but had no significant difference with that in roots and leaves（P>0.05）. The expression of CsMAPKK3 was down-regulated by cold stress，but up-regulated by abscisic acid（ABA），salt and drought treatments. 【Conclusion】The expression of CsMAPKK3 is tissue-specific，and it is involved in the tea plant response to ABA，high salt，low temperature and drought stresses. Key words： Camellia sinensis; CsMAPKK3 gene; gene cloning; bioinformatics analysis; expression analysis; stress
Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31800587）; Education Research Project for Young and Middle-aged Teachers of Education Department of Fujian（JAT170160）
0 引言
【研究意义】在逆境胁迫下，植物可通过促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases，MAPKs）级联途径响应，经过MAPKKK（MAPK kinase kinase）-MAPKK（MAPK kinase）-MAPK的依次磷酸化作用，将外界逆境信号级联放大并传递至下游，调控相应的生理生化反应（Hamel et al.，2006）。目前，国内外学者对MAPKs级联途径的研究越来越多，结果发现MAPKs级联途径在植物生长发育、抗病及非生物胁迫响应、植物激素信号转导通路和乙烯信号转导过程中均发挥重要作用（赵琳琳等，2008）。茶树喜好温暖湿润的生长环境，且偏好酸性土壤，低温、干旱和高盐等逆境条件下会导致茶树生长发育不良甚至死亡，对成茶品质产生严重影响。因此，研究茶树MAPKs级联途径相关基因对其抗逆境胁迫的分子机制研究及抗逆育种具有重要意义。【前人研究进展】MAPKK是双特异性蛋白酶，在MAPKs级联途径中，上游被激活的MAPKKK能磷酸化MAPKK中保守的S/T-X3-5-S/T（S为丝氨酸，T为苏氨酸，X为任意氨基酸）基序（Wu et al.，2014），从而激活MAPKK，然后MAPKK通过对MAPK活化环中T-X-Y（T为苏氨酸，Y为酪氨酸）基序的磷酸化而激活MAPK，最终通过激活的MAPK来激活下游应答因子将胞外逆境信号传递到细胞内进行响应。植物MAPKK在MAPKs级联途径中的成员数量最少。据报道，拟南芥基因组中至少存在60个AtMAPKKK基因和20个AtMAPK基因，但仅10个AtMAPKK基因被鉴定出（张振才等，2014）。根据S/T-X3-5-S/T保守结构和D激活位点，AtMAPKK基因家族可区分为A、B、C和D 4个亚族，其中AtMAPKK1、AtMAPKK2和AtMAPKK6属于A亚族，AtMAPKK3属于B亚族，AtMAPKK4和AtMAPKK5属于C亚族，AtMAPKK7、AtMAPKK8、AtMAPKK9和AtMAPKK10属于D亚族（Hamel et al.，2006）。此外，MAPKK是上游逆境信号的聚集点，也是下游MAPK的分支点，因此，对MAPKK功能的揭示是明确MAPKs级联反应途径作用机制的关键（Xu et al.，2010）。在逆境胁迫下，植物不同组织中的MAPKK基因表达量会发生上调或下调变化，然后通过MAPKs级联途径传导胁迫信号，最终通过激素调控、渗透调节、氧化还原和信号转导等对非生物胁迫作出应答。拟南芥AtMKK1基因参与多种拟南芥响应生物和非生物胁迫过程中的信號转导，包括对脱落酸（ABA）的响应调控（蔡国华等，2013）;将玉米ZmMKK1基因转入拟南芥中，可提高转基因植株的耐盐性和抗旱性（Cai et al.，2014）;棉花GhMKK3基因在响应干旱胁迫下被诱导上调表达，表明该基因参与干旱胁迫响应调控（Wang et al.，2016）。【本研究切入点】目前鲜见有关茶树MAPKK基因及MAPK信号通路在茶树抗逆过程中作用机制的研究报道。【拟解决的关键问题】克隆茶树CsMAPKK3基因cDNA全长序列，对其进行生物信息学分析，并检测该基因在外源ABA、盐胁迫、干旱胁迫和低温胁迫下的表达模式，并从茶树（舒茶早）基因组数据库中检索该基因的启动子序列，分析其顺式作用元件，为深入研究茶树MAPKK基因响应逆境胁迫中的分子机制和调控机理提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试材料为3年生盆栽茶树品种铁观音的茶苗。多糖多酚植物总RNA提取试剂盒购自杭州开泰生物有限公司;Easy Script @One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒和Transstart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒购自厦门泰京生物技术有限公司。主要仪器设备：GeIDoc It TS3 Imager凝胶成像仪（Bio-Rad，美国）、CFX96 Touch荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）、T100TM Thermal Cycler PCR仪（Bio-Rad，美国）、琼脂糖水平电泳仪和电泳槽（北京六一仪器有限公司）、AIRTECH紫外超净工作台（苏州安泰科技有限公司）和NanoDrop ND2000超微量分光光度计（Thermo Scientific，赛默飞世尔科技公司）。
1. 2 样品处理及采集
取供试材料的根、茎、叶、花和果实，每组织设3次生物学重复。参照曹红利等（2017）的方法对材料进行低温（4 ℃）、ABA（100 μmol/L ABA）、高盐（150 mmol/L NaCl）和干旱（100 g/L PEG）4种胁迫处理，分别在处理后3、9和24 h进行取样，以0 h为对照，每处理设3次生物学重复。所取样品经液氮速冻后放-80 ℃冰箱保存备用。
1. 3 总RNA提取及cDNA合成
根据多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明提取总RNA，利用NanoDrop ND2000超微量分光光度计测定其浓度，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，置于-80 ℃冰箱保存备用。按照Easy Script@One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明将所提取的总RNA反转录合成cDNA第一链，用于逆转录PCR（RT-PCR）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测。 1. 4 基因克隆及启动子序列分析
根据本课题组前期试验获得的茶树低温转录组数据库中的基因注释，筛选出1个MAPKK3基因序列，将该参考序列在NCBI中进行比对后显示其含有完整的开放阅读框（ORF），因此设计ORF上、下游扩增引物（表1），按照PrimeSTAR HS试剂盒的说明配制50.0 μL体系进行PCR扩增。扩增程序：94 ℃预变性30 s，98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 90 s，共进行30个循环。PCR产物回收测序后与原序列拼接，最终获得该基因的cDNA序列。并根据cDNA序列在舒茶早茶树基因组数据库中检索，获得其密码子上游序列2000 bp的序列，最终得到1714 bp启动子序列。
1. 5 生物信息学分析
利用NCBI数据库中的BLASTn和BLASTp对CsMAPKK3基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行同源性分析，并利用DNAMAN 6.0将CsMAPKK3与同源蛋白序列进行多重比对。使用ExPASy在线工具中的ProtParam预测CsMAPKK3蛋白的理化性质;使用SingalP 3.0预测其信号肽;利用TMHMM 2.0预测其跨膜螺旋结构域;采用NetPhos 3.1 Server预测其磷酸化位点;利用Plant-mPLoc和WOLF PSORT预测其亚细胞定位。将获得的CsMAPKK3基因启动子序列提交至PlantCARE中对其逆境相关顺式作用元件进行预测。利用MEGA 7.0的邻接法（Neighbor-joining method）构建系统发育进化树。
1. 6 qRT-PCR检测
通过qRT-PCR检测CsMAPKK3基因在茶树不同组织及4种胁迫处理下的表达情况，以CsPTB为内参基因，定量PCR引物见表1。参照Transstart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒说明配制反应体系（20.0 μL），包括2×TransTaq HiFiPCR SuperMix 10.0 μL，cDNA模板1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性30 s;94 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s，共进行40个循环。采用2-ΔCt算法计算目的基因在组织中的相对表达量，2-ΔΔCt算法计算其在非生物胁迫下的相对表达量。
1. 7 统计分析
使用SPSS 22.0对数据采用LSD法和Dunnett法进行显著性分析（P<0.05），使用Excel 2020绘制柱形圖。
2 结果与分析
2. 1 CsMAPKK3基因克隆及序列分析结果
如图1所示，CsMAPKK3基因ORF的PCR产物约1500 bp，与预期结果相符，其测序结果显示，该序列为1557 bp，与参考序列拼接后，获得cDNA全长为1941 bp。CsMAPKK3基因编码518个氨基酸残基，且氨基酸序列中含有D（I/L/V）K激活域以及S/T-X3-5-S/T保守域（图2）。该基因序列已提交至GenBank，登录号为AUD40506.1。
2. 2 生物信息学分析结果
ProtParam预测结果显示，CsMAPKK3蛋白分子式为C2566H3996N682O768S26，相对分子量为57.52 kD，含酸性氨基酸（Asp+Glu）63个、碱性氨基酸（Arg+Lys）48个，理论等电点（pI）为5.39，不稳定系数为42.07，属于不稳定蛋白。TMHMM 2.0预测结果（图3）显示，CsMAPKK3蛋白无跨膜螺旋结构和信号肽。SignalP 3.0信号肽预测结果与TMHMM预测结果相同，即该蛋白无信号肽。
NetPhos 3.1 Server预测结果（图4）显示，CsMAPKK3蛋白含有52个能被磷酸化的位点（超过阈值线），其中包括27个Ser位点、16个Thr和9个Tyr位点，主要被unsp、cdc2、CKII和INSR等蛋白激酶磷酸化。Plant-mPLoc预测结果显示，CsMAPKK3蛋白定位于细胞核;WOLF PSORT预测结果显示，其定位于细胞质和细胞核（K值分别为11和2），故推测CsMAPKK3蛋白的亚细胞定位可能定位于细胞质和细胞核中。利用NCBI中BLASTp对CsMAPKK3蛋白功能结构域进行分析，结果（图5）发现，CsMAPKK3蛋白属于PKc类型的MAPKK，且具有SPS1、S_TKc等催化结构域。
用NCBI数据库中BLASTn对CsMAPKK3基因进行同源比对，结果显示该基因与葡萄（Vitis vini-fera）MAPKK3基因（GenBank登录号MT154083.1）的相似性最高，达85%，与栓皮栎（Quercus suber）MAPKK3基因（GenBank登录号XM_024032986.1）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）MAPKK3基因（GenBank登录号XM_021788394.1）的相似性均达84%。从NCBI数据库下载CsMAPKK3的同源蛋白氨基酸序列，并利用DNAMAN 6.0进行多重序列比对，结果（图6）显示，CsMAPKK3、拟南芥AtMKK3、玉米ZmMKK3和中华猕猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis）PSS35243.1序列中均含D（I/L/V）K激活域和S/T-X3-5-S/T保守域。以CsMAPKK3蛋白与拟南芥的10个AtMAPKK蛋白构建系统发育进化树，结果（图7）显示，CsMAPKK3蛋白与拟南芥B亚家族聚为一类，其中，与AtMKK3蛋白关系最近。以CsMAPKK3蛋白与其他17种植物的MAPKK蛋白构建系统发育进化树，结果（图8）表明，CsMAPKK3蛋白与中华猕猴桃PSS35243.1亲缘关系最近。 2. 3 CsMAPKK3基因启动子顺式作用元件分析结果
在PlantCARE中对茶树CsMAPKK3基因启动子序列进行顺式作用元件预测分析，结果（表2）显示，启动子区含有与光响应相关元件如ACE、ATCT-motif、Box 4、MRE和TCCC-motif等，以及多种逆境响应相关元件如TC-rich repeats等。此外，还含有与植物激素响应相关元件如脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element等，以及与厌氧诱导相关元件如ARE等。
2. 4 CsMAPKK3基因在不同组织及逆境胁迫处理下表达模式分析结果
CsMAPKK3基因在根、茎、叶、花和果中均有表达，其中在茎和果的表达量较高，显著高于花中的表达量，但与根和叶中的表达量均无显著差异（P>0.05）（图9-A）。CsMAPKK3基因在4种逆境胁迫处理（ABA、高盐、低温和干旱）下的表达量检测结果如图9-B～图9-E所示。ABA处理后CsMAPKK3基因较处理0时显著上调表达（P<0.05，下同），在9 h时达最大值（图9-B）;高盐胁迫处理也能显著诱导CsMAPKK3基因显著上调表达，在3 h时达最大值（图9-C）;低温胁迫处理下CsMAPKK3基因的表达模式与其他3个处理完全相反，其表达量呈显著下调趋势，在24 h时达最小值（图9-D）;干旱胁迫处理下CsMAPKK3基因的表达量与ABA处理呈相似的变化趋势，在9 h时显著上调表达，表达量达最大值（图9-E）。推测CsMAPKK3基因参与茶树ABA、高盐、低温和干旱胁迫响应调控。
3 讨论
自Ichimura等（1998）首次从模式植物拟南芥中鉴定出1条完整的MAPKs级联途径AtMEKK1-AtMKK1-AtMPK4，并证明其能传递干旱和机械损伤信号后，Teige等（2004）也在拟南芥中发现另一条MAPKs级联途径AtMEKK1-AtMAPKK2-AtMAPK4/AtMAPK6，并证实其参与抵御盐胁迫和低温胁迫;Schrnidt等（2013）研究发现MAPKs级联途径OsMEKK6-OsMAPK5参与水稻根部对盐胁迫的信号转导。可见，MAPKs级联途径在响应非生物胁迫中发挥重要作用，而MAPKK作为连接上游MAPKKK和下游MAPK的信号枢纽，是MAPKs级联途径中的关键点（单鸿轩和付畅，2017）。本研究克隆获得CsMAPKK3基因，并进行组织表达特性及非生物胁迫下表达模式分析，以期为研究MAPKs级联途径在茶树中的抗逆作用机制提供参考。CsMAPKK3亚细胞定位结果显示其可能定位于细胞质和细胞核中，与玉米ZmMKK3蛋白定位在细胞质和细胞核中的预测结果一致（Zhang et al.，2012）。而在此前与MAPKK定位相关的研究中，发现大多MAPKK蛋白定位于细胞质（Song et al.，2015），但也有定位于细胞核（Song et al.，2015）的报道，可能是由于MAPKK在细胞质中被上游MAPKKK激活，随后转移至细胞核磷酸化其下游的MAPK所导致。
本研究发现，CsMAPKK3基因启动子序列中含有与响应ABA胁迫和水杨酸等激素信号分子相关的多种顺式作用元件，推测该基因参与激素信号分子调控，从而影响植物生长发育。且通过qRT-PCR检测发现，CsMAPKK3基因在茶树茎和果中的表达量较高，与黄瓜CsMAPK4-2基因在果实中表达量最高，其旁系同源基因CsMAPK4-1在茎中的表达量较高的结果相似（Wang et al.，2015）;CsMAPKK3基因受高盐和干旱胁迫诱导表达显著上调，推测该基因可能参与茶树耐盐和抗旱响应。李粲等（2012）克隆获得甘蔗SoMAPK4基因，并证实该基因可能参与多种生物和非生物胁迫响应的信号传导。Song等（2015）研究发现，西瓜ClMKK3基因受非生物（干旱、高盐、高温和ABA）胁迫不同程度诱导上调表达，但低温胁迫抑制其显著下调表达，表明该基因在逆境胁迫中发挥重要调控功能;ClMKK5基因在西瓜枯萎菌侵染后第9 d时的表达量是对照的6倍，表明该基因在西瓜抗枯萎病过程中发挥重要调控功能（Song et al.，2015）。张演义等（2015）对葡萄MAPKK基因家族进行鉴定分析，结果发现MAPKK基因家族对植物生长发育细胞周期调控以及响应环境胁迫方面有重要作用。
基于前人对植物抗旱耐盐基因的研究结果，发现这些基因主要包括渗透调节基因、蛋白类基因（如信号传导中的蛋白激酶基因）及转录因子基因（陈丽萍和何道一，2010）。CsMAPKK3基因则属于蛋白类基因。蛋白磷酸化及去磷酸化过程在细胞的信号识别和转导中发挥重要作用，而细胞信号识别和转导又直接影响植物体对环境变化的感应和对逆境信息的传递，故在这个过程中蛋白激酶发挥重要的作用。通过蛋白质组学研究发现，在逆境條件下许多与逆境相关的蛋白表达量会发生明显变化（付晨熙等，2016）。因此，后续应重点研究CsMAPKK3蛋白在逆境中的调控机制及CsMAPKK3基因在MAPKs级联途径中的作用分子机制。
4 结论
CsMAPKK3基因表达具有组织表达特异性，且参与茶树ABA、高盐、低温和干旱胁迫响应等逆境胁迫的分子调控。
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（責任编辑 陈 燕）