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摘要：荧光原位杂交（FISH）分子技术目前在肿瘤检测、产前诊断及血液类疾病治疗等应用越来越普遍，因其观测结果客观、准确，很受临床检测部门青睐。但是FISH技术的成本并不低，样本还处于人工处理为主的阶段，工作强度大，人员素养要求高，极大妨碍了FISH技术的推广和普及。通过对样本处理工艺的研究，本文基于单片机STM32F107为主控芯片提出设计一种高通量自动脱蜡设备，以STM32F103为电机驱动板芯片，控制三轴位移平台按照实驗流程依次将样本切片移动到指定的试剂缸中反应，实现样本切片的自动脱蜡处理。
关键词：STM32；脱蜡；自动化； 高通量；精确控制
中图分类号：TP311 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2018）29-0235-04
Abstract： Fluorescence in situ hybridization （FISH） molecular technology is increasingly used in tumor detection， prenatal diagnosis and treatment of blood diseases. Because of its objective and accurate observation results， it is very popular among clinical testing departments. However， the cost of FISH technology is not low， and the sample is still in the stage of manual processing. The work intensity is high and the personnel literacy requirements are high， which greatly hinders the promotion and popularization of FISH technology. Based on the research of sample processing technology， this paper proposes a high-throughput automatic dewaxing device based on STM32F107 as the main control chip. The STM32F103 is used as the motor driving chip. The three-axis displacement platform is controlled to move the sample slice to the experimental flow. The reaction in the designated reagent cylinder enables automatic dewaxing of the sample sections.
Key words： STM32； dewaxing； automation； high throughput； precise control
组织石蜡切片的常规脱蜡方法是人工将切片依次放入装有不同试剂的试剂缸中进行脱蜡处理。该脱蜡方法中不仅操作烦琐，需要多个反应腔体，而且需要有专人进行操作，容易出现操作顺序错误。为了改善这种情况，到目前为止，改良的脱蜡方法有通过蠕动泵抽送，或通过对腔体抽真空来完成试剂更换，但这些方法都还是存在制作成本高的缺点。目前国内社区医院及生物研究所对切片进行脱蜡的手段大部分都是人工在操作，脱蜡设备步骤烦琐，使用的试剂部分对人体有伤害，这样使得在操作中如有步骤的遗漏或是试剂的混用将会导致脱蜡的失败。为了防止在切片脱蜡中实验人员对切片的烦琐操作导致切片的不均一性及不成功，提高脱蜡效率，保证脱蜡质量，实现全自动脱蜡，已成为未来病理检测和各个社区医院及生物研究所的迫切需要和技术发展趋势。在这样的环境下致使我们开发了一套能够对组织切片进行脱蜡、蛋白酶消化等过程的自动化设备。
1高通量自动脱蜡仪整体设计
系统采用一主多从的树形架构。主控板以STM32F107为控制核心，通过总线通信组织协调各子板共同完成整个系统的业务功能。系统包含两类共四个从机模块：X轴电机驱动、Y轴电机驱动、Z轴电机驱动、温度控制模块，各从机模块均以STM32F103为核心，分别完成步进电机驱动和温度控制的功能。通过一主多从的协调配合，系统能够稳定高效地完成所有动作。另外，本课题开发了一套串口屏程序，提供良好的人机交互操作。
2 机械设计
2.1 三轴位移平台
本设计中三轴位移平台主要用于承载机械臂勾手进行定位，使勾手能够准确地移动到染色架下方将其提起，因此三轴位移平台的负重比较小，采用悬臂式结构，能够让整个设备的结构更加轻便，与此同时也起到了节约成本的作用。其中，X轴安装在设备背板处，Y轴通过滑块和X轴连接在一起，Z轴同样是固定在Y轴的滑块上。机械臂勾手固定安装在Z轴的滑块上，利用这一套三轴位移平台，机械臂勾手可以运动到行程内的任意位置钩取及放置染色架，从而实现样本切片与不同试剂的反应。
2.2 反应缸
为了实现样本切片的高通量处理，本设备中的反应缸设计有4个放置染色架的工位，因此便具备了同时处理最多96片样本的条件。由于脱蜡反应过程中的脱蜡剂具有很强的腐蚀性，因此存放脱蜡剂的不锈钢反应缸必须镀有特氟龙涂层才能保证正常使用。本设备中共使用了12个反应缸，其中4个反应缸中存放的试剂需要加热，因此需要在其表面贴上加热膜以及连接温度传感器，故而这四个反应缸的排废只能通过在其底部打孔通过蠕动泵抽取来实现。
2.3 整体结构 完成了各功能模块的设计后，开始进行设备的整体框架堆叠。根据设备的功能需求，我们考虑将其设计成双层的结构。打开设备盖子后，用户可看到表层放置有12个反应缸，在设备开启之前，用户可将试剂倒入反应缸中，并将装有样本切片的染色架放在反应缸的指定工位，之后通过程序控制三轴位移平台的移动即可将样本切片按照预设流程移动到指定的染色缸中进行反应。在设备底层中放置了对反应缸进行排废处理的蠕动泵，而右侧则是电源及电路板的安装固定位。这种设计能够较好地避免设备发生试剂外泄时引起的短路以及元件的腐蚀损坏，防止发生安全事故。
3高通量自動脱蜡仪硬件电路设计
3.1 主控板电路设计
3.1.1 最小系统
和51单片机相同，STM32单片机的最小系统同样包含有复位电路以及晶振时钟电路。复位电路是在单片机启动时能够将元件各个部件都设置为初始状态，并由初始状态开始进行工作。在设计中采用RC按钮式复位电路。时钟电路对于某些单片机来说可有可无，因为部分单片机内部有集成的振荡电路，不接外部晶振也可以，但是精度比较低，可以用来进行低速通信或者信号处理。而在没有集成时钟电路的芯片中，则必须要外接时钟晶振源。为了使系统更加稳定可靠，这里使用外部时钟电路。如下图所示：
3.1.2 电源模块
本系统中所要使用的电压有 3.3V、 24V。 24V市场可以直接采购，而 3.3V则需要DC-DC芯片转换得到，这里采用的是逐级降压方式达到 3.3V，即提供了 5V电压又可实现 3.3V的输出。首先使用LM2596-5将电压降至 5V，然后再使用ASM1117-3.3V稳压芯片将 5V稳至 3.3V。电源电路根据各个稳压芯片的推介电路设计完成，电路中输入是通过电容来完成电压的滤波功能，输出处电感与电容则是用来减小输出电压纹波，在24-5V电源中由于LM2596-5是开关型降压调节器，当通电时电流正常流过，当关闭时电感里储存的电需要放掉，连接了一个二极管放电，保证电路不断电，所以该二极管又叫作续流二极管。电路板如图6所示。
3.1.3 串口通信模块
对于一个系统而言，与外界的通信显得尤为重要，不仅可以获取外界所发的指令或信号，也可给向外部传达消息。这里采用的是基于串口通讯接口的RS485和RS232的通讯。串口中有三种通讯方式，分别是单工，顾名思义就是只能朝着一个方向传输；半双工，可以双向通讯，但同一时刻一个信道只允许朝着一个方向传输和全双工，在任意时刻可以同时发送和接收。本文STM32F107芯片一共有5个USART是一个全双工通用同步/异步串行收发模块，这里使用USART1与显示屏通信，电路原理图如图7所示。
3.2温控板电路设计
高通量脱蜡仪的温控板主要功能是调节试剂温度，使得在试剂在参加反应的时候达到所需要的温度。温控板与主板之间采用CAN总线通信，通过DS18B20采集实时温度，通过调节PWM波的占空比调节输出功率，达到温度稳定控制的目的。根据加热块的材料以及和设定温度和当前温度的差值设定合适的快速升温速率。
3.2.1 DS18B20温度采集
DS18B20采用5V供电，可以将DS18B20与主控芯片直接连接，通过读写操作进行读取温度值。
3.2.2温度控制
整个温度控制的过程，可以根据经验或者实验或者程序自整定出合适的加热曲线，在整个加热曲线的设置过程中，由于一些物质温度变化的滞后性，可能会导致温度控制不准确，以及最后温度稳定精度。为了使得温度在尽短的时间内升到需要的温度，并且能够保持稳定状态，在加热的初期，一般采用快速加热，并且温度采样周期尽可能快，形成快速的闭环反馈，不至于温度超调，在中期缩减加热速度，使得文段达到比较稳定的状态，再缓慢升温。
如图9所示，通过改变PA6端口输出的PWM波的占空比，调节MOS管的导通和关断时间，控制加热块的工作时间，达到温度调节的目的。由于加热块所需工作电流较大，一般不采用直接用芯片直接驱动，而是使用大功率MOS管，间接控制加热块。
3.3电机驱动板电路设计
该芯片包含了逻辑模块和功率模块配合简单的外围电路即可实现步进电机的驱动功能，电路设计十分简单，最低低至两路信号（脉冲、方向）控制即可。参考芯片的推荐电路及现有的驱动板电路，设计的电路原理图如图10所示，主要包含细分电路，是由一个3位拨码开关控制电机的8种细分；电位器，调整驱动电流的大小和衰减模式选择电压；正反转控制端口；一路脉冲输入端口；电机接线端。电机驱动板作为设备的一个子板，与主板之间采用CAN总线通信。
4 高通量自动脱蜡仪的软件设计
软件设计主要以脱蜡处理流程为中心，通过运动控制切换不同试剂与切片进行反应，辅助以温度控制。通过上位机发送命令，下位机接收到命令，并对上位机发送的命令进行判断，如果命令没有错误，再对命令解码，然后执行相对应的硬件动作。上位机开发是基于串口屏，串口屏具有良好的人机交互界面，能够很直观简洁地让用户进行操作。下位机程序的开发是基于 Keil μVision5 平台，包括了 STM32F107 和 STM32F103 两款芯片，能够很好地融合。
下位机程序以完成整个脱蜡流程为主要目的，配合温度控制程序实现整个实验所需要的温度条件。下位机的程序主要包括接收来自显示屏的操作指令和根据实验流程给其他子板发送命令。整个下位机程序以脱蜡实验流程为主要功能，包括初始化、烤片、脱蜡、通透、酶消化、洗涤、脱水和干片几个步骤，每个步骤对应相应的试剂位置，程序运行到相应流程时，通过控制三轴运动，使得样本切片运动到指定区域，完成实验流程。
显示屏主要是显示一些基本参数以及供用户设置参数，作为人机交互的直接媒介，对于用户的使用体验至关重要，它赋予了用户最简洁、自然和方便的使用方式。触摸屏因其反应速度很快、交流直观、坚固耐用、节省空间等诸多优点，被广泛应用于各大智能设备，如计算机、手机、游戏机、平板电脑等。
5结束语
该装置能够自动化实现石蜡病理切片的脱蜡、蛋白酶消化等过程。实现传统制片过程中烦琐步骤的自动化处理：完成石蜡切片的全自动脱蜡、脱水和酶消化的功能。而脱蜡后的病理切片可以用来进行细胞FISH实验，广泛应用在临床疾病的诊断上，如肿瘤，血液病，产前诊断等。
参考文献：
[1]刘晶晶. 全自动生化分析仪电气系统的设计研究[D]. 江苏科技大学， 2013.
[2]于建勇. 浅谈时钟电路在单片机中的作用[D]. 硅谷， 2011.
[3]付晓鸥. 《光电接近开关测量物位》实训教学“资料包”的设计[D]. 福建电脑， 2012.
[4]祝敏. 也谈光电耦合器[D]. 电子制作， 2004.
[5]郑喆俊. 宽带超声电机驱动电源研究[D]. 上海交通大学， 2008.
[6]李峻宇. 基于STM32F107的瓦斯继电器校验装置的设计[D]. 武汉纺织大学， 2014.
【通联编辑：唐一东】
关键词：STM32；脱蜡；自动化； 高通量；精确控制
中图分类号：TP311 文献标识码：A 文章编号：1009-3044（2018）29-0235-04
Abstract： Fluorescence in situ hybridization （FISH） molecular technology is increasingly used in tumor detection， prenatal diagnosis and treatment of blood diseases. Because of its objective and accurate observation results， it is very popular among clinical testing departments. However， the cost of FISH technology is not low， and the sample is still in the stage of manual processing. The work intensity is high and the personnel literacy requirements are high， which greatly hinders the promotion and popularization of FISH technology. Based on the research of sample processing technology， this paper proposes a high-throughput automatic dewaxing device based on STM32F107 as the main control chip. The STM32F103 is used as the motor driving chip. The three-axis displacement platform is controlled to move the sample slice to the experimental flow. The reaction in the designated reagent cylinder enables automatic dewaxing of the sample sections.
Key words： STM32； dewaxing； automation； high throughput； precise control
组织石蜡切片的常规脱蜡方法是人工将切片依次放入装有不同试剂的试剂缸中进行脱蜡处理。该脱蜡方法中不仅操作烦琐，需要多个反应腔体，而且需要有专人进行操作，容易出现操作顺序错误。为了改善这种情况，到目前为止，改良的脱蜡方法有通过蠕动泵抽送，或通过对腔体抽真空来完成试剂更换，但这些方法都还是存在制作成本高的缺点。目前国内社区医院及生物研究所对切片进行脱蜡的手段大部分都是人工在操作，脱蜡设备步骤烦琐，使用的试剂部分对人体有伤害，这样使得在操作中如有步骤的遗漏或是试剂的混用将会导致脱蜡的失败。为了防止在切片脱蜡中实验人员对切片的烦琐操作导致切片的不均一性及不成功，提高脱蜡效率，保证脱蜡质量，实现全自动脱蜡，已成为未来病理检测和各个社区医院及生物研究所的迫切需要和技术发展趋势。在这样的环境下致使我们开发了一套能够对组织切片进行脱蜡、蛋白酶消化等过程的自动化设备。
1高通量自动脱蜡仪整体设计
系统采用一主多从的树形架构。主控板以STM32F107为控制核心，通过总线通信组织协调各子板共同完成整个系统的业务功能。系统包含两类共四个从机模块：X轴电机驱动、Y轴电机驱动、Z轴电机驱动、温度控制模块，各从机模块均以STM32F103为核心，分别完成步进电机驱动和温度控制的功能。通过一主多从的协调配合，系统能够稳定高效地完成所有动作。另外，本课题开发了一套串口屏程序，提供良好的人机交互操作。
2 机械设计
2.1 三轴位移平台
本设计中三轴位移平台主要用于承载机械臂勾手进行定位，使勾手能够准确地移动到染色架下方将其提起，因此三轴位移平台的负重比较小，采用悬臂式结构，能够让整个设备的结构更加轻便，与此同时也起到了节约成本的作用。其中，X轴安装在设备背板处，Y轴通过滑块和X轴连接在一起，Z轴同样是固定在Y轴的滑块上。机械臂勾手固定安装在Z轴的滑块上，利用这一套三轴位移平台，机械臂勾手可以运动到行程内的任意位置钩取及放置染色架，从而实现样本切片与不同试剂的反应。
2.2 反应缸
为了实现样本切片的高通量处理，本设备中的反应缸设计有4个放置染色架的工位，因此便具备了同时处理最多96片样本的条件。由于脱蜡反应过程中的脱蜡剂具有很强的腐蚀性，因此存放脱蜡剂的不锈钢反应缸必须镀有特氟龙涂层才能保证正常使用。本设备中共使用了12个反应缸，其中4个反应缸中存放的试剂需要加热，因此需要在其表面贴上加热膜以及连接温度传感器，故而这四个反应缸的排废只能通过在其底部打孔通过蠕动泵抽取来实现。
2.3 整体结构 完成了各功能模块的设计后，开始进行设备的整体框架堆叠。根据设备的功能需求，我们考虑将其设计成双层的结构。打开设备盖子后，用户可看到表层放置有12个反应缸，在设备开启之前，用户可将试剂倒入反应缸中，并将装有样本切片的染色架放在反应缸的指定工位，之后通过程序控制三轴位移平台的移动即可将样本切片按照预设流程移动到指定的染色缸中进行反应。在设备底层中放置了对反应缸进行排废处理的蠕动泵，而右侧则是电源及电路板的安装固定位。这种设计能够较好地避免设备发生试剂外泄时引起的短路以及元件的腐蚀损坏，防止发生安全事故。
3高通量自動脱蜡仪硬件电路设计
3.1 主控板电路设计
3.1.1 最小系统
和51单片机相同，STM32单片机的最小系统同样包含有复位电路以及晶振时钟电路。复位电路是在单片机启动时能够将元件各个部件都设置为初始状态，并由初始状态开始进行工作。在设计中采用RC按钮式复位电路。时钟电路对于某些单片机来说可有可无，因为部分单片机内部有集成的振荡电路，不接外部晶振也可以，但是精度比较低，可以用来进行低速通信或者信号处理。而在没有集成时钟电路的芯片中，则必须要外接时钟晶振源。为了使系统更加稳定可靠，这里使用外部时钟电路。如下图所示：
3.1.2 电源模块
本系统中所要使用的电压有 3.3V、 24V。 24V市场可以直接采购，而 3.3V则需要DC-DC芯片转换得到，这里采用的是逐级降压方式达到 3.3V，即提供了 5V电压又可实现 3.3V的输出。首先使用LM2596-5将电压降至 5V，然后再使用ASM1117-3.3V稳压芯片将 5V稳至 3.3V。电源电路根据各个稳压芯片的推介电路设计完成，电路中输入是通过电容来完成电压的滤波功能，输出处电感与电容则是用来减小输出电压纹波，在24-5V电源中由于LM2596-5是开关型降压调节器，当通电时电流正常流过，当关闭时电感里储存的电需要放掉，连接了一个二极管放电，保证电路不断电，所以该二极管又叫作续流二极管。电路板如图6所示。
3.1.3 串口通信模块
对于一个系统而言，与外界的通信显得尤为重要，不仅可以获取外界所发的指令或信号，也可给向外部传达消息。这里采用的是基于串口通讯接口的RS485和RS232的通讯。串口中有三种通讯方式，分别是单工，顾名思义就是只能朝着一个方向传输；半双工，可以双向通讯，但同一时刻一个信道只允许朝着一个方向传输和全双工，在任意时刻可以同时发送和接收。本文STM32F107芯片一共有5个USART是一个全双工通用同步/异步串行收发模块，这里使用USART1与显示屏通信，电路原理图如图7所示。
3.2温控板电路设计
高通量脱蜡仪的温控板主要功能是调节试剂温度，使得在试剂在参加反应的时候达到所需要的温度。温控板与主板之间采用CAN总线通信，通过DS18B20采集实时温度，通过调节PWM波的占空比调节输出功率，达到温度稳定控制的目的。根据加热块的材料以及和设定温度和当前温度的差值设定合适的快速升温速率。
3.2.1 DS18B20温度采集
DS18B20采用5V供电，可以将DS18B20与主控芯片直接连接，通过读写操作进行读取温度值。
3.2.2温度控制
整个温度控制的过程，可以根据经验或者实验或者程序自整定出合适的加热曲线，在整个加热曲线的设置过程中，由于一些物质温度变化的滞后性，可能会导致温度控制不准确，以及最后温度稳定精度。为了使得温度在尽短的时间内升到需要的温度，并且能够保持稳定状态，在加热的初期，一般采用快速加热，并且温度采样周期尽可能快，形成快速的闭环反馈，不至于温度超调，在中期缩减加热速度，使得文段达到比较稳定的状态，再缓慢升温。
如图9所示，通过改变PA6端口输出的PWM波的占空比，调节MOS管的导通和关断时间，控制加热块的工作时间，达到温度调节的目的。由于加热块所需工作电流较大，一般不采用直接用芯片直接驱动，而是使用大功率MOS管，间接控制加热块。
3.3电机驱动板电路设计
该芯片包含了逻辑模块和功率模块配合简单的外围电路即可实现步进电机的驱动功能，电路设计十分简单，最低低至两路信号（脉冲、方向）控制即可。参考芯片的推荐电路及现有的驱动板电路，设计的电路原理图如图10所示，主要包含细分电路，是由一个3位拨码开关控制电机的8种细分；电位器，调整驱动电流的大小和衰减模式选择电压；正反转控制端口；一路脉冲输入端口；电机接线端。电机驱动板作为设备的一个子板，与主板之间采用CAN总线通信。
4 高通量自动脱蜡仪的软件设计
软件设计主要以脱蜡处理流程为中心，通过运动控制切换不同试剂与切片进行反应，辅助以温度控制。通过上位机发送命令，下位机接收到命令，并对上位机发送的命令进行判断，如果命令没有错误，再对命令解码，然后执行相对应的硬件动作。上位机开发是基于串口屏，串口屏具有良好的人机交互界面，能够很直观简洁地让用户进行操作。下位机程序的开发是基于 Keil μVision5 平台，包括了 STM32F107 和 STM32F103 两款芯片，能够很好地融合。
下位机程序以完成整个脱蜡流程为主要目的，配合温度控制程序实现整个实验所需要的温度条件。下位机的程序主要包括接收来自显示屏的操作指令和根据实验流程给其他子板发送命令。整个下位机程序以脱蜡实验流程为主要功能，包括初始化、烤片、脱蜡、通透、酶消化、洗涤、脱水和干片几个步骤，每个步骤对应相应的试剂位置，程序运行到相应流程时，通过控制三轴运动，使得样本切片运动到指定区域，完成实验流程。
显示屏主要是显示一些基本参数以及供用户设置参数，作为人机交互的直接媒介，对于用户的使用体验至关重要，它赋予了用户最简洁、自然和方便的使用方式。触摸屏因其反应速度很快、交流直观、坚固耐用、节省空间等诸多优点，被广泛应用于各大智能设备，如计算机、手机、游戏机、平板电脑等。
5结束语
该装置能够自动化实现石蜡病理切片的脱蜡、蛋白酶消化等过程。实现传统制片过程中烦琐步骤的自动化处理：完成石蜡切片的全自动脱蜡、脱水和酶消化的功能。而脱蜡后的病理切片可以用来进行细胞FISH实验，广泛应用在临床疾病的诊断上，如肿瘤，血液病，产前诊断等。
参考文献：
[1]刘晶晶. 全自动生化分析仪电气系统的设计研究[D]. 江苏科技大学， 2013.
[2]于建勇. 浅谈时钟电路在单片机中的作用[D]. 硅谷， 2011.
[3]付晓鸥. 《光电接近开关测量物位》实训教学“资料包”的设计[D]. 福建电脑， 2012.
[4]祝敏. 也谈光电耦合器[D]. 电子制作， 2004.
[5]郑喆俊. 宽带超声电机驱动电源研究[D]. 上海交通大学， 2008.
[6]李峻宇. 基于STM32F107的瓦斯继电器校验装置的设计[D]. 武汉纺织大学， 2014.
【通联编辑：唐一东】