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【摘 要】 目的 探讨COX-2在乳腺浸润性导管癌中的表达及其临床意义。方法 采用Elisa方法检测65例单侧乳腺浸润性导管癌患者组织及癌旁组织中COX-2及炎症因子（TNF-α、IL-1β）的表达，并分析COX-2的表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理特征的关系。结果 ① 在65例乳腺浸润性导管癌病理组织中，COX-2蛋白阳性表达率均高于其在癌旁组织及乳腺良性肿瘤中的阳性表达率，两者之间存在显著性差异（P〈0.01）；② COX-2的表达与区域淋巴结转移、组织细胞学分级和TNM分期成正相关（P〈0.05）；与患者年龄、肿瘤大小及ER、PR的表达无明显相关性。 ③ 乳腺浸润性导管癌病理组织中COX-2的表达与炎症因子（TNF-α、IL-1β）的表达成正相关，TNF-α及IL-1β在乳腺浸润性导管癌病理组织中亦呈现高表达（P〈0.01）。结论 在乳腺浸润性导管癌组织中COX-2的表达增高与其临床病理特征密切相关；COX-2的过表达伴随着相关炎症因子TNF-α、IL-1β的表达增高，表明COX-2除了在促进乳腺浸润性导管癌肿瘤细胞增殖及迁徙方面发挥了重要作用，同时也说明其在促进炎症因子参与肿瘤发生发展中起到关键作用。
【关键词】 COX-2 乳腺浸润性导管癌 临床病理特征 炎症因子
1 材料与方法
1.1 标本
收集江苏省常州市xxx医院201x年x月至201x年x月行单侧乳腺癌根治术患者，且组织病理类型确诊为乳腺浸润性导管癌病理组织共65例；16例良性乳腺疾病术后组织标本作为阴性对照。患者均为女性，发病年龄为29-77岁，中位年龄53岁。依据2009年美国癌症联合会（AJCC）修订的乳腺癌分期第7版标准，进行TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期32例，Ⅲ期18例。肿瘤最大直径小于2cm者28例，大于2cm者37例。伴有腋窝淋巴结转移22例，无腋窝淋巴结转移43例。组织细胞学分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级33例，Ⅲ级20例。术前均未经放、化疗及内分泌治疗。距离肿瘤组织周边2-5cm组织且经病理学证实该组织中存在散在癌细胞为癌旁组织。
1.2 检测试剂
蛋白质抽提所需试剂，如Tris-base、SDS、β-巯基乙醇等均购自SIGMA公司；检测COX-2、TNF-α、IL-1β及ER、PR所需ELISA试剂盒均购自上海麦约尔生物技术有限公司。
1.3 实验方法
取术后病人新鲜组织标本约50mg，于灭菌的1.5ML Eppendorf管中，先加入500uL蛋白抽提液后用碾磨棒充分碾碎组织至看不见组织碎块，然后补充蛋白抽提液至800uL混匀，冰上静置10分钟，10000rpm离心10分钟后取上清至另一灭菌的1.5ML Eppendorf管中，重复上述步骤一次，即获得所需细胞提取上清，以备Elisa检测上清中的COX-2、TNF-α、IL-1β及ER、PR蛋白表达。
依据Elisa试剂盒中的实验方法，将按照上述方法提取的乳腺浸润性导管癌组织及癌旁组织、乳腺良性肿瘤组织上清加入已经包被了COX-2、TNF-α、IL-1β及ER、PR相应抗体的96孔板中，检测COX-2及各指标之间的蛋白表达水平。
1.4 组织细胞学分级标准
根据2011年NCCN乳腺癌临床实践指南推荐使用Nottingham联合组织学分级（Nottingham Combined Histology Grade， Scarff-bloom-Richardson分级系统的Elston-Ellis修正版），分为3级。
1.5 统计学方法
应用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。两样本均数比较采用t检验；2个分类变量之间有无关联性采用χ2 检验；2个独立样本等级强度差别采用Wilcoxon秩和检验；多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 乳腺浸润性导管癌及癌旁组织、乳腺良性腫瘤COX-2的表达
与乳腺良性肿瘤组织相比，COX-2在乳腺浸润性导管癌组织呈现高表达（P〈0.01），在癌旁组织中的表达水平介于乳腺良性肿瘤和导管癌之间，但存在周围淋巴结转移的癌旁组织中COX-2的表达明显高于无淋巴转移的癌旁组织，两者之间亦存在统计学差异；然而无淋巴转移癌旁组织与乳腺良性肿瘤，及有淋巴转移癌旁组织与乳腺浸润性导管癌两者之间COX-2的表达不存在统计学差异。其表达量的高低与肿瘤组织大小并无相关性，却与导管癌的区域淋巴结转移成正相关（图1）。
Elisa检测乳腺浸润性导管癌组织中COX-2的蛋白表达水平。如图1所示，与有淋巴转移的导管癌癌旁组织相比，乳腺浸润性导管癌组织中COX-2的表达较高，但两者之间不存在统计学差异；而与无淋巴结转移的癌旁组织及乳腺良性肿瘤相比较，前两者的COX-2的表达显著高于后两者的表达，其间存在统计学差异（P〈0.01）。
2.2 COX-2的表达与临床病理特征的关系
我们检测了COX-2的表达与部分临床病理指标的相关性，如表1所示，COX-2的表达与区域淋巴结转移、组织细胞学分级及TNM分期成正相关（P〈0.05）；与患者年龄、肿瘤组织大小、ER及PR的表达无显著相关性（P>0.05）。
2.3 COX-2的表达与乳腺浸润性导管癌相关炎症因子表达的相关性
我们同时检测了乳腺浸润性导管癌及癌旁组织中相关炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达。检测发现，与COX-2的表达基本一致，TNF-α和IL-1β在乳腺浸润性导管癌组织中呈现较高的表达水平，在癌旁组织中表达略有降低，但与乳腺良性肿瘤相比较两者之间仍具有统计学差异（P〈0.05）。COX-2作为促进炎症因子合成的关键酶，其表达水平的增高与相关炎症因子的表达趋势一致，表明COX-2在肿瘤组织促炎症反应中起到了重要作用。 乳腺浸润性导管癌组织中TNF-α和IL-1β的表达水平与COX-2基本一致，在导管癌组织中高表达（P〈0.01），在有周围淋巴结转移的癌旁组织中低表达（P〈0.05），而在无淋巴转移的癌旁组织中的表达与乳腺良性肿瘤之间无显著性差异（P>0.05）。
3 讨论
COX-2是前列腺素合成过程中的关键限速酶，可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，进而维持机体的正常生理及病理过程。大量研究表明，COX-2的过量表达与乳腺癌的发生发展密切相关。COX-2通过促进前列腺素E2的合成促进肿瘤细胞的增殖，而前列腺素E2在表皮生长因子的刺激作用下促进乳腺细胞增长，其同样也能够通过刺激雌激素分泌增加促进肿瘤细胞的增殖。与此同时，COX-2还可通过抑制肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管形成及肿瘤细胞的转移而促进肿瘤发生和发展。从早期的细胞增生到肿瘤细胞的远处转移，COX-2的高表达贯穿了肿瘤发生发展的全过程，因此，COX-2在肿瘤的发生及发展过程中起到了非常重要的作用。
有研究表明，COX-2促进乳腺癌发生的相关机制包括：促进肿瘤细胞增殖、促进新生血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤细胞侵袭。然而除了在促进细胞增殖与侵袭方面的作用，COX-2同样能够促进肿瘤组织中前列腺素的合成，具有促进炎症反应的作用，非甾体类抗炎药（NSAIDs）即通过作用于COX-2，抑制前列腺素的合成从而发挥了良好的抗炎作用。因此，研究COX-2在乳腺浸润性导管癌肿瘤组织的表达及与其临床病理因素相关性的同时，进一步了解COX-2与炎症因子表达的相关性，以便能够进一步了解COX-2在促进肿瘤组织炎症发生中的作用，及炎症因子在促进肿瘤发生发展中的作用。
我们研究表明，COX-2在乳腺浸润性导管癌组织呈现高表达（P〈0.01），在癌旁组织中的表达水平介于乳腺良性肿瘤和导管癌之间，同时，存在周围淋巴结转移的癌旁组织中COX-2的表达亦高于无淋巴结转移的癌旁组织，两者之间亦存在统计学差异（图1）。通过检测COX-2的表达与部分临床病理指标的相关性，我们发现，COX-2的表达与区域淋巴结转移、组织细胞学分级及TNM分期成正相关（P〈0.05）；与患者年龄、肿瘤组织大小、ER及PR的表达无显著相关性（P>0.05）。因此，COX-2的高表达能够促进肿瘤细胞增殖、转移及侵袭，COX-2的表达水平越高，肿瘤的分化程度越低，增殖能力越强，转移及侵袭能力也越强。因此，我们可以将COX-2的表达水平作为衡量肿瘤恶性程度的一个指标。由于COX-2是前列腺素合成的限速酶，因此，其还参与肿瘤组织相关炎症反应，我们同时检测了乳腺浸润性导管癌组织、癌旁组织中TNF-α和IL-1β的表达，从而进一步了解COX-2在肿瘤组织促进炎症反应中的作用。与COX-2在乳腺浸润性导管癌中表达相似的是，TNF-α和IL-1β在癌症及癌旁组织中也处于高表达（图2），因此，COX-2的高表达是伴随着相关炎症因子的释放，在其促进肿瘤细胞增殖迁移的同时，促使相关炎症因子参与了肿瘤细胞的发生与发展，使得肿瘤细胞增殖速度更快，更易导致淋巴结转移。因此，通过抑制COX-2的表达，能够起到抑制细胞增殖与迁移，对影响乳腺浸润性导管癌的转归具有一定的作用。
由于COX-2与乳腺浸润性导管癌的发生发展密切相关，2002年美国癌症协会首次提出将COX-2抑制剂作为乳腺癌预防和治疗的新靶点。COX-2抑制剂分为非选择性（NSAIDs）和选择性（塞来昔布），已有动物实验证实COX-2抑制剂能够减少实验诱导的小鼠乳腺癌发病率，并且肺转移灶数目减少，提示COX-2抑制剂对于治疗早期和转移性乳腺癌均有意义。由于环境的不断惡化和生活习惯的改变，乳腺癌作为当今世界主要威胁女性健康的疾病之一，其发病率逐年上升，因此，探讨乳腺癌的发病机制，寻找抗癌药物新的作用靶点非常重要。COX-2在乳腺浸润性导管癌中表达显著增高，其表达增高与肿瘤淋巴结转移、组织细胞学分级、TNM分期具有密切的相关性，与相关炎症因子的表达亦成正相关，因此推测，COX-2在癌症的发生发展及预后中起到了非常重要的作用，运用COX-2抑制剂来抑制乳腺浸润性导管癌的发展将成为肿瘤治疗的又一途径。
参考文献
[1]Fan L， Strasser-Weippl K， et al.， Breast cancer in China. Lancet Oncol. 2014 Jun；15（7）：e279-89.
[2]DeSantis C， Ma J， Bryan L， Jemal A. Breast cancer statistics， 2013. CA Cancer J Clin. 2014 Jan-Feb；64（1）：52-62
[3]Karavitis J， Zhang M. COX2 regulation of breast cancer bone metastasis. Oncoimmunology. 2013 Mar 1； 2（3）：e23129.
[4]Prueitt RL， Boersma BJ， et al.， Inflammation and IGF-I activate the Akt pathway in breast cancer. Int J Cancer. 2007 Feb 15； 120（4）：796-805.
【关键词】 COX-2 乳腺浸润性导管癌 临床病理特征 炎症因子
1 材料与方法
1.1 标本
收集江苏省常州市xxx医院201x年x月至201x年x月行单侧乳腺癌根治术患者，且组织病理类型确诊为乳腺浸润性导管癌病理组织共65例；16例良性乳腺疾病术后组织标本作为阴性对照。患者均为女性，发病年龄为29-77岁，中位年龄53岁。依据2009年美国癌症联合会（AJCC）修订的乳腺癌分期第7版标准，进行TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期32例，Ⅲ期18例。肿瘤最大直径小于2cm者28例，大于2cm者37例。伴有腋窝淋巴结转移22例，无腋窝淋巴结转移43例。组织细胞学分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级33例，Ⅲ级20例。术前均未经放、化疗及内分泌治疗。距离肿瘤组织周边2-5cm组织且经病理学证实该组织中存在散在癌细胞为癌旁组织。
1.2 检测试剂
蛋白质抽提所需试剂，如Tris-base、SDS、β-巯基乙醇等均购自SIGMA公司；检测COX-2、TNF-α、IL-1β及ER、PR所需ELISA试剂盒均购自上海麦约尔生物技术有限公司。
1.3 实验方法
取术后病人新鲜组织标本约50mg，于灭菌的1.5ML Eppendorf管中，先加入500uL蛋白抽提液后用碾磨棒充分碾碎组织至看不见组织碎块，然后补充蛋白抽提液至800uL混匀，冰上静置10分钟，10000rpm离心10分钟后取上清至另一灭菌的1.5ML Eppendorf管中，重复上述步骤一次，即获得所需细胞提取上清，以备Elisa检测上清中的COX-2、TNF-α、IL-1β及ER、PR蛋白表达。
依据Elisa试剂盒中的实验方法，将按照上述方法提取的乳腺浸润性导管癌组织及癌旁组织、乳腺良性肿瘤组织上清加入已经包被了COX-2、TNF-α、IL-1β及ER、PR相应抗体的96孔板中，检测COX-2及各指标之间的蛋白表达水平。
1.4 组织细胞学分级标准
根据2011年NCCN乳腺癌临床实践指南推荐使用Nottingham联合组织学分级（Nottingham Combined Histology Grade， Scarff-bloom-Richardson分级系统的Elston-Ellis修正版），分为3级。
1.5 统计学方法
应用SPSS17.0统计软件包进行数据分析。两样本均数比较采用t检验；2个分类变量之间有无关联性采用χ2 检验；2个独立样本等级强度差别采用Wilcoxon秩和检验；多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验。检验水准为α=0.05。
2 结果
2.1 乳腺浸润性导管癌及癌旁组织、乳腺良性腫瘤COX-2的表达
与乳腺良性肿瘤组织相比，COX-2在乳腺浸润性导管癌组织呈现高表达（P〈0.01），在癌旁组织中的表达水平介于乳腺良性肿瘤和导管癌之间，但存在周围淋巴结转移的癌旁组织中COX-2的表达明显高于无淋巴转移的癌旁组织，两者之间亦存在统计学差异；然而无淋巴转移癌旁组织与乳腺良性肿瘤，及有淋巴转移癌旁组织与乳腺浸润性导管癌两者之间COX-2的表达不存在统计学差异。其表达量的高低与肿瘤组织大小并无相关性，却与导管癌的区域淋巴结转移成正相关（图1）。
Elisa检测乳腺浸润性导管癌组织中COX-2的蛋白表达水平。如图1所示，与有淋巴转移的导管癌癌旁组织相比，乳腺浸润性导管癌组织中COX-2的表达较高，但两者之间不存在统计学差异；而与无淋巴结转移的癌旁组织及乳腺良性肿瘤相比较，前两者的COX-2的表达显著高于后两者的表达，其间存在统计学差异（P〈0.01）。
2.2 COX-2的表达与临床病理特征的关系
我们检测了COX-2的表达与部分临床病理指标的相关性，如表1所示，COX-2的表达与区域淋巴结转移、组织细胞学分级及TNM分期成正相关（P〈0.05）；与患者年龄、肿瘤组织大小、ER及PR的表达无显著相关性（P>0.05）。
2.3 COX-2的表达与乳腺浸润性导管癌相关炎症因子表达的相关性
我们同时检测了乳腺浸润性导管癌及癌旁组织中相关炎症因子TNF-α、IL-1β的蛋白表达。检测发现，与COX-2的表达基本一致，TNF-α和IL-1β在乳腺浸润性导管癌组织中呈现较高的表达水平，在癌旁组织中表达略有降低，但与乳腺良性肿瘤相比较两者之间仍具有统计学差异（P〈0.05）。COX-2作为促进炎症因子合成的关键酶，其表达水平的增高与相关炎症因子的表达趋势一致，表明COX-2在肿瘤组织促炎症反应中起到了重要作用。 乳腺浸润性导管癌组织中TNF-α和IL-1β的表达水平与COX-2基本一致，在导管癌组织中高表达（P〈0.01），在有周围淋巴结转移的癌旁组织中低表达（P〈0.05），而在无淋巴转移的癌旁组织中的表达与乳腺良性肿瘤之间无显著性差异（P>0.05）。
3 讨论
COX-2是前列腺素合成过程中的关键限速酶，可将花生四烯酸代谢成各种前列腺素产物，进而维持机体的正常生理及病理过程。大量研究表明，COX-2的过量表达与乳腺癌的发生发展密切相关。COX-2通过促进前列腺素E2的合成促进肿瘤细胞的增殖，而前列腺素E2在表皮生长因子的刺激作用下促进乳腺细胞增长，其同样也能够通过刺激雌激素分泌增加促进肿瘤细胞的增殖。与此同时，COX-2还可通过抑制肿瘤细胞凋亡、抑制新生血管形成及肿瘤细胞的转移而促进肿瘤发生和发展。从早期的细胞增生到肿瘤细胞的远处转移，COX-2的高表达贯穿了肿瘤发生发展的全过程，因此，COX-2在肿瘤的发生及发展过程中起到了非常重要的作用。
有研究表明，COX-2促进乳腺癌发生的相关机制包括：促进肿瘤细胞增殖、促进新生血管生成、抑制肿瘤细胞凋亡及促进肿瘤细胞侵袭。然而除了在促进细胞增殖与侵袭方面的作用，COX-2同样能够促进肿瘤组织中前列腺素的合成，具有促进炎症反应的作用，非甾体类抗炎药（NSAIDs）即通过作用于COX-2，抑制前列腺素的合成从而发挥了良好的抗炎作用。因此，研究COX-2在乳腺浸润性导管癌肿瘤组织的表达及与其临床病理因素相关性的同时，进一步了解COX-2与炎症因子表达的相关性，以便能够进一步了解COX-2在促进肿瘤组织炎症发生中的作用，及炎症因子在促进肿瘤发生发展中的作用。
我们研究表明，COX-2在乳腺浸润性导管癌组织呈现高表达（P〈0.01），在癌旁组织中的表达水平介于乳腺良性肿瘤和导管癌之间，同时，存在周围淋巴结转移的癌旁组织中COX-2的表达亦高于无淋巴结转移的癌旁组织，两者之间亦存在统计学差异（图1）。通过检测COX-2的表达与部分临床病理指标的相关性，我们发现，COX-2的表达与区域淋巴结转移、组织细胞学分级及TNM分期成正相关（P〈0.05）；与患者年龄、肿瘤组织大小、ER及PR的表达无显著相关性（P>0.05）。因此，COX-2的高表达能够促进肿瘤细胞增殖、转移及侵袭，COX-2的表达水平越高，肿瘤的分化程度越低，增殖能力越强，转移及侵袭能力也越强。因此，我们可以将COX-2的表达水平作为衡量肿瘤恶性程度的一个指标。由于COX-2是前列腺素合成的限速酶，因此，其还参与肿瘤组织相关炎症反应，我们同时检测了乳腺浸润性导管癌组织、癌旁组织中TNF-α和IL-1β的表达，从而进一步了解COX-2在肿瘤组织促进炎症反应中的作用。与COX-2在乳腺浸润性导管癌中表达相似的是，TNF-α和IL-1β在癌症及癌旁组织中也处于高表达（图2），因此，COX-2的高表达是伴随着相关炎症因子的释放，在其促进肿瘤细胞增殖迁移的同时，促使相关炎症因子参与了肿瘤细胞的发生与发展，使得肿瘤细胞增殖速度更快，更易导致淋巴结转移。因此，通过抑制COX-2的表达，能够起到抑制细胞增殖与迁移，对影响乳腺浸润性导管癌的转归具有一定的作用。
由于COX-2与乳腺浸润性导管癌的发生发展密切相关，2002年美国癌症协会首次提出将COX-2抑制剂作为乳腺癌预防和治疗的新靶点。COX-2抑制剂分为非选择性（NSAIDs）和选择性（塞来昔布），已有动物实验证实COX-2抑制剂能够减少实验诱导的小鼠乳腺癌发病率，并且肺转移灶数目减少，提示COX-2抑制剂对于治疗早期和转移性乳腺癌均有意义。由于环境的不断惡化和生活习惯的改变，乳腺癌作为当今世界主要威胁女性健康的疾病之一，其发病率逐年上升，因此，探讨乳腺癌的发病机制，寻找抗癌药物新的作用靶点非常重要。COX-2在乳腺浸润性导管癌中表达显著增高，其表达增高与肿瘤淋巴结转移、组织细胞学分级、TNM分期具有密切的相关性，与相关炎症因子的表达亦成正相关，因此推测，COX-2在癌症的发生发展及预后中起到了非常重要的作用，运用COX-2抑制剂来抑制乳腺浸润性导管癌的发展将成为肿瘤治疗的又一途径。
参考文献
[1]Fan L， Strasser-Weippl K， et al.， Breast cancer in China. Lancet Oncol. 2014 Jun；15（7）：e279-89.
[2]DeSantis C， Ma J， Bryan L， Jemal A. Breast cancer statistics， 2013. CA Cancer J Clin. 2014 Jan-Feb；64（1）：52-62
[3]Karavitis J， Zhang M. COX2 regulation of breast cancer bone metastasis. Oncoimmunology. 2013 Mar 1； 2（3）：e23129.
[4]Prueitt RL， Boersma BJ， et al.， Inflammation and IGF-I activate the Akt pathway in breast cancer. Int J Cancer. 2007 Feb 15； 120（4）：796-805.