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摘要[目的]对油棕乙酰CoA羧化酶（ACC）基因进行鉴定与表达分析。[方法]采用生物信息学方法鉴定油棕的ACC基因，并应用拟南芥的ACC基因蛋白質序列比对油棕的蛋白质库，应用已有油棕转录组信息，研究ACC基因在不同组织中的表达情况。[结果]在油棕中鉴定了2个ACC基因，命名为EgACC1和EgACC2。EgACC1不含内含子，而EgACC2含有32个内含子；EgACC1在不同组织中都没有表达，而EgACC2在所有组织中都有表达，其中在组培苗中有较高的表达量，同时，在油棕果发育21 d时有高的表达水平，RPKM值为70.6，为所有组织中最高。[结论]该研究阐述了油棕ACC基因的表达模式，为油棕ACC基因的功能分析奠定了基础。
关键词油棕；ACC基因；转录组；RPKM
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0154-02
Abstract[Objective]To study the identification and expression profile of acetyl CoA carboxylase （ACC） in Elaeis guineensis.[Method]To identify ACC genes in E.guineensis by using bioinformatics，ACC genes protein sequence of Arabidopsis thaliana were used to align with protein database of E.guineensis.The transcription group information of E.guineensis was applied to study the expression of ACC genes in different tissues.[Result] Two ACC genes were identified in the genome of E.guineensis，which were named as EgACC1 and EgACC2，respectively.Among them，EgACC1 do not contain intron，however EgACC2 contain thirty two introns.The expression of EgACC1 was not detected in different tissues of E.guineensis.However，the expression of EgACC2 was detected in all tissues.High expression levels were examined in tissue culture seedling.Meanwhile，highest expression level was detected at 21 day of mesocarp development，RPKM value was 70.6.[Conclusion]These study demonstrated that the expression pattern of ACC genes and provided basic work for functional analysis of ACC genes in E.guineensis.
Key wordsElaeis guineensis；ACC gene；Transcriptome；RPKM
油棕是重要的热带木本油料作物，是一种重要的热带木本油料作物，油棕果的含油量在50%以上，1株油棕产油30～40 kg，平均产油4 500 kg/hm2，因单位面积产油量高，而被称为“世界油王”[1]。油棕的中果皮和果仁都能产油，其中果皮压榨的油为棕榈油，棕榈油的主要成分为棕榈酸，十六碳的饱和脂肪酸（C16∶0），而油棕果仁压榨的油为棕榈仁油，棕榈仁油的脂肪酸成分类似于椰子油，其主要成分为月桂酸，十二碳的饱和脂肪酸（C12∶0）。棕榈油脂肪酸的饱和程度非常高，不易被氧化，被认为是奶油和反式脂肪酸的很好替代品，我国65%的棕榈油都用于做人造奶油、起酥油、煎炸油、家庭烹调用的调和油及其他食品专用油[2]。棕榈酸是目前世界上生产量、消费量和国际贸易量最大的植物油种类，年产油量超过5 000万t，2003—2004年度，我国棕榈油消费总量约为574.9万t，进口量约占世界进口总量的13.38%，我国棕榈油消费主要依赖于进口，因而培育我国棕榈油产业非常重要。
脂肪酸合成的前体为乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA为底物进行连续的聚合反应，以每次循环增加2个碳的频率合成酰基碳链 [3]。ACC是脂肪酸生物合成的关键酶之一，自然界中有2种存在形式：一种为多功能酶，而另一种为多酶复合体。前者含有3个功能结构域，被称为真核形式的ACC，后者可被分解多个功能蛋白，如生物素羧化酶，生物素羧基载体蛋白，羧基转移酶和另外一个功能未知蛋白，被称为原核形式的ACC[4-5]。
笔者应用生物信息学，研究ACC基因的结构和保守结构域，并研究不同物种ACC基因的进化关系，分析ACC基因在油棕组织中的表达情况。
1材料与方法
1.1ACC基因的鉴定
油棕的全基因组序列从NCBI（the National Center for Biotechnology Information）网站上下载，拟南芥的ACC基因从TAIR（the Arabidopsis Information Resource）网站上下载，为了鉴定油棕的ACC基因，将拟南芥ACC蛋白质序列与油棕的蛋白质数据库进行Blastp比对，比对的E值的阈值为1e-10，将预测的油棕ACC蛋白质序列与CDD （http：//www.ncbi.nlm.gov.cdd）和PFAM数据库（http：//pfam.sanger.ac.uk）进行比对。 1.2ACC基因结构分析
油棕基因组的注释结果从NCBI（the National Center for Biotechnology Information）网站上下载，ACC基因结构采用GSDS（the Gene Structure Display Server Programme）软件进行展示。
1.3ACC基因的表达分析
油棕的32个转录组的原始reads数据从NCBI网站的SRA数据库（Sequence Read Archive）中下载，这些转录组分别来自于油棕的中果皮、叶子、果、花、根和茎。为了检测ACC基因在油棕不同组织中的表达，对AAC基因RPKM值进行计算，计算公式如下：
RPKM= 106CNL/103
在该公式中，C代表比对在某一个表达基因序列上的reads的条数，N代表比对上所有表达序列的总reads数，L代表对应的基因序列的长度[6]。
2结果与分析
2.1油棕ACC基因的鉴定从TAIR网站挖掘ACC基因，有2个基因为丙二酰CoA（ACC），分别为At1g36160和At1g36180。用拟南芥的这2个基因的蛋白质序列与油棕的蛋白质库进行Blastp，设定阈值为1e-10。在油棕的基因组上，发现了2个同源基因，其中1个EgACC基因位于油棕第3染色体上， 而另外1个EgACC基因未能定在油棕的染色体上。这2个EgACC基因的长度分别为1 164和18 256 bp。序列长度较短的ACC基因命名为EgACC1，而序列较长的ACC基因命名为EgACC2。
2.2EgACC基因的结构分析这2个基因的结构，结果显示EgACC1并不含有内含子，总基因的长度为1 164 bp，而EgACC2含有32个内含子，外显子最短的只有40 bp，而最长的外显子有2 157 bp，平均每个外显子222.75 bp。
2.3不同物种ACC基因的聚类分析下载拟南芥、油菜、油茶、花生、玉米、大豆以及油棕ACC基因的蛋白质序列，并采用Joining Neighbour的方法，对这些蛋白质序列进行聚类，聚类结构显示：拟南芥、油茶、玉米、油茶的ACC基因聚在一块，而油棕的ACC2和大豆的ACC2基因聚在一块，花生的ACC与大豆ACC1基因聚在一块，而油棕的ACC1被单独地聚在一类。ACC2基因在所有组织中都检测到表达量。
2.4油棕ACC基因在不同组织中的表达
下载油棕的32个转录组的数据，这些转录组分别来自于油棕发育不同时期的中果皮、根、茎、叶、花、果。依据这些转录组的原始数据计算RPKM值，油棕的ACC1基因在所有组织中都没有表达，而ACC2在不同的组织都有表达量，ACC2基因在油棕的组培苗中有高的表达量，同时在油棕果发育21 d时有高的表达水平，RPKM值为70.6，为所有组织中最高。
3讨论
油棕是一种重要热带油料作物，因产油量高，而被称为“世界油王”。油棕的基因组已被测序，测序结果显示：油棕基因组为1.53 Gb，预测了34 802个基因，在该研究中，应用拟南芥ACC蛋白质序列比对油棕的蛋白质库，并鉴定2个油棕的ACC基因，分别命名为EgACC1和EgACC2。对这2个ACC的基因结构进行分析，分析结果显示：EgACC1不含内含子，而EgACC2含有32个内含子，同时，研究了这2个EgACC基因在油棕组培苗以及不同组织中的表达，同时也研究这2个ACC基因在油棕中果皮发育不同时期的表达变化，结果显示：EgACC1在所有组织中都没有表达，而EgACC2在所有组织中都有表达，该基因在组培苗中有较高的表达量，同时，在油棕果发育21 d有高的表达水平，RPKM值为70.6，为所有组织中最高。
在脂类代谢的研究中，拟南芥是重要的模式植物，目前已研究了该物种中包括脂肪酸从头合成，三酰基甘油合成和脂肪酸三酰基甘油降解等23条代谢途径，脂肪酸合成的前体为乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶復合物（fatty acid synthetase complex，FAS）以丙二酸单酰CoA为底物进行聚合反应，以每次循环2个碳的频率合成酰基碳链[7]。而不断地增加酰基碳链与酰基载体蛋白结合，以保护其不受代谢途径中多种酶的侵蚀。一些研究已表明：FAS常为酮酯酰基ACP合成酶，多次反应加碳后，脂肪酸可以在酰基ACP硫酯酶（acyl-ACP thioesterase）或酰基转移酶（acyltransferase）的作用下终止。
ACC酶有2种形式，即多功能酶和多酶复合体，前者被称为真核形式的ACC，而后者被称为原核形式的ACC，原核形式的ACC可以被分为几个多功能的亚基，即生物羧化酶、生物素羧基载体蛋白、羧基转移酶和另一个未知功能的蛋白。在单子叶作物（ 如小麦、玉米和水稻）中的ACC酶为真核形式，这些ACC酶对aryloxy phenoxy propionates和cyclo hexane diones这2种除草剂非常敏感。但是在双子叶植物豌豆和烟草中，ACC为原核形式。Gengenbach等[8]检测了ACC基因在高油黄豆和低油黄豆中的表达量，结果显示，在高油黄豆中ACC基因的表达量是低油黄豆的2倍，特别是在发育的早期和中期，这些结果暗示ACC基因的表达与黄豆脂肪酸的积累具有较高的相关性。Ohlrogge等[9]将油棕种子储藏蛋白的启动子与拟南芥的ACC基因连接，并转化油菜，在T1代，拟南芥的脂肪酸含量增加5.0%～6.4%。Sellwood等[10]通过反义表达技术，抑制ACC基因的表达，转基因植株的含油量显著降低。
参考文献
[1]
BASRI W M，ABDULLAH S N A，HENSON I E.Oil palm：Achievements and potential[J].Plant production science，2005，8（3）：288-297. [2] KOH L P，WILCOVE D S.Cashing in palm oil for conservation[J].Nature，2007，448：993-994.
[3] 李昌珠，李正茂.植物脂肪酸的生物合成及其生理功能的研究進展[J].湖南林业科技，2009，36（6）：45-49.
[4] ASHTON A R，JENKINS C L D，WHITFIELD P R.Molecular cloning of two different cDNAs for malize acetyl CoA carboxylase[J].Plant Mol Biol，1994，24（1）：35-49.
[5] ALBAN C，BALDET P，DOUCE J.Localization and characterization of two structurally different forms of acetylCoA carboxylase in young pea leaves，of which one is sensitive to aryloxyphenoxy propionate herbicides[J].Biochem J，1994，30：557-565.
[6] MORTAZAVI A，WILLIAMS B A，MCCUE K，et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNASeq[J].Nat Methods，2008，5（7）：621-628.
[7] OHLROGGE J，BROWSE J.Lipid biosynthesis[J].Plant cell，1995，7（7）：957-970.
[8] GENGENBACH B G，SOMERS D A，WYSE D L，et al.Transgenic plants expressing maize acetyl CoA carboxylase gene and method of altering oil content：6222099[P].2001-04-24.
[9] OHLROGGE J B，ROESLER K R，SHORROSH B S.Method of increasing oil content of seeds：5925805[P].1999-07-20.
[10] SELLWOOD C，SLABAS A R，RAWSTHORNE S.Effects of manipulating expression of acetyplCoA carboxylasel in Brassica napus L.embryos[J].Biochemical society，2000，28（6）：598-600.
关键词油棕；ACC基因；转录组；RPKM
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）31-0154-02
Abstract[Objective]To study the identification and expression profile of acetyl CoA carboxylase （ACC） in Elaeis guineensis.[Method]To identify ACC genes in E.guineensis by using bioinformatics，ACC genes protein sequence of Arabidopsis thaliana were used to align with protein database of E.guineensis.The transcription group information of E.guineensis was applied to study the expression of ACC genes in different tissues.[Result] Two ACC genes were identified in the genome of E.guineensis，which were named as EgACC1 and EgACC2，respectively.Among them，EgACC1 do not contain intron，however EgACC2 contain thirty two introns.The expression of EgACC1 was not detected in different tissues of E.guineensis.However，the expression of EgACC2 was detected in all tissues.High expression levels were examined in tissue culture seedling.Meanwhile，highest expression level was detected at 21 day of mesocarp development，RPKM value was 70.6.[Conclusion]These study demonstrated that the expression pattern of ACC genes and provided basic work for functional analysis of ACC genes in E.guineensis.
Key wordsElaeis guineensis；ACC gene；Transcriptome；RPKM
油棕是重要的热带木本油料作物，是一种重要的热带木本油料作物，油棕果的含油量在50%以上，1株油棕产油30～40 kg，平均产油4 500 kg/hm2，因单位面积产油量高，而被称为“世界油王”[1]。油棕的中果皮和果仁都能产油，其中果皮压榨的油为棕榈油，棕榈油的主要成分为棕榈酸，十六碳的饱和脂肪酸（C16∶0），而油棕果仁压榨的油为棕榈仁油，棕榈仁油的脂肪酸成分类似于椰子油，其主要成分为月桂酸，十二碳的饱和脂肪酸（C12∶0）。棕榈油脂肪酸的饱和程度非常高，不易被氧化，被认为是奶油和反式脂肪酸的很好替代品，我国65%的棕榈油都用于做人造奶油、起酥油、煎炸油、家庭烹调用的调和油及其他食品专用油[2]。棕榈酸是目前世界上生产量、消费量和国际贸易量最大的植物油种类，年产油量超过5 000万t，2003—2004年度，我国棕榈油消费总量约为574.9万t，进口量约占世界进口总量的13.38%，我国棕榈油消费主要依赖于进口，因而培育我国棕榈油产业非常重要。
脂肪酸合成的前体为乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA为底物进行连续的聚合反应，以每次循环增加2个碳的频率合成酰基碳链 [3]。ACC是脂肪酸生物合成的关键酶之一，自然界中有2种存在形式：一种为多功能酶，而另一种为多酶复合体。前者含有3个功能结构域，被称为真核形式的ACC，后者可被分解多个功能蛋白，如生物素羧化酶，生物素羧基载体蛋白，羧基转移酶和另外一个功能未知蛋白，被称为原核形式的ACC[4-5]。
笔者应用生物信息学，研究ACC基因的结构和保守结构域，并研究不同物种ACC基因的进化关系，分析ACC基因在油棕组织中的表达情况。
1材料与方法
1.1ACC基因的鉴定
油棕的全基因组序列从NCBI（the National Center for Biotechnology Information）网站上下载，拟南芥的ACC基因从TAIR（the Arabidopsis Information Resource）网站上下载，为了鉴定油棕的ACC基因，将拟南芥ACC蛋白质序列与油棕的蛋白质数据库进行Blastp比对，比对的E值的阈值为1e-10，将预测的油棕ACC蛋白质序列与CDD （http：//www.ncbi.nlm.gov.cdd）和PFAM数据库（http：//pfam.sanger.ac.uk）进行比对。 1.2ACC基因结构分析
油棕基因组的注释结果从NCBI（the National Center for Biotechnology Information）网站上下载，ACC基因结构采用GSDS（the Gene Structure Display Server Programme）软件进行展示。
1.3ACC基因的表达分析
油棕的32个转录组的原始reads数据从NCBI网站的SRA数据库（Sequence Read Archive）中下载，这些转录组分别来自于油棕的中果皮、叶子、果、花、根和茎。为了检测ACC基因在油棕不同组织中的表达，对AAC基因RPKM值进行计算，计算公式如下：
RPKM= 106CNL/103
在该公式中，C代表比对在某一个表达基因序列上的reads的条数，N代表比对上所有表达序列的总reads数，L代表对应的基因序列的长度[6]。
2结果与分析
2.1油棕ACC基因的鉴定从TAIR网站挖掘ACC基因，有2个基因为丙二酰CoA（ACC），分别为At1g36160和At1g36180。用拟南芥的这2个基因的蛋白质序列与油棕的蛋白质库进行Blastp，设定阈值为1e-10。在油棕的基因组上，发现了2个同源基因，其中1个EgACC基因位于油棕第3染色体上， 而另外1个EgACC基因未能定在油棕的染色体上。这2个EgACC基因的长度分别为1 164和18 256 bp。序列长度较短的ACC基因命名为EgACC1，而序列较长的ACC基因命名为EgACC2。
2.2EgACC基因的结构分析这2个基因的结构，结果显示EgACC1并不含有内含子，总基因的长度为1 164 bp，而EgACC2含有32个内含子，外显子最短的只有40 bp，而最长的外显子有2 157 bp，平均每个外显子222.75 bp。
2.3不同物种ACC基因的聚类分析下载拟南芥、油菜、油茶、花生、玉米、大豆以及油棕ACC基因的蛋白质序列，并采用Joining Neighbour的方法，对这些蛋白质序列进行聚类，聚类结构显示：拟南芥、油茶、玉米、油茶的ACC基因聚在一块，而油棕的ACC2和大豆的ACC2基因聚在一块，花生的ACC与大豆ACC1基因聚在一块，而油棕的ACC1被单独地聚在一类。ACC2基因在所有组织中都检测到表达量。
2.4油棕ACC基因在不同组织中的表达
下载油棕的32个转录组的数据，这些转录组分别来自于油棕发育不同时期的中果皮、根、茎、叶、花、果。依据这些转录组的原始数据计算RPKM值，油棕的ACC1基因在所有组织中都没有表达，而ACC2在不同的组织都有表达量，ACC2基因在油棕的组培苗中有高的表达量，同时在油棕果发育21 d时有高的表达水平，RPKM值为70.6，为所有组织中最高。
3讨论
油棕是一种重要热带油料作物，因产油量高，而被称为“世界油王”。油棕的基因组已被测序，测序结果显示：油棕基因组为1.53 Gb，预测了34 802个基因，在该研究中，应用拟南芥ACC蛋白质序列比对油棕的蛋白质库，并鉴定2个油棕的ACC基因，分别命名为EgACC1和EgACC2。对这2个ACC的基因结构进行分析，分析结果显示：EgACC1不含内含子，而EgACC2含有32个内含子，同时，研究了这2个EgACC基因在油棕组培苗以及不同组织中的表达，同时也研究这2个ACC基因在油棕中果皮发育不同时期的表达变化，结果显示：EgACC1在所有组织中都没有表达，而EgACC2在所有组织中都有表达，该基因在组培苗中有较高的表达量，同时，在油棕果发育21 d有高的表达水平，RPKM值为70.6，为所有组织中最高。
在脂类代谢的研究中，拟南芥是重要的模式植物，目前已研究了该物种中包括脂肪酸从头合成，三酰基甘油合成和脂肪酸三酰基甘油降解等23条代谢途径，脂肪酸合成的前体为乙酰CoA，它首先在乙酰CoA羧化酶的作用下合成丙二酰CoA，然后脂肪酸合成酶復合物（fatty acid synthetase complex，FAS）以丙二酸单酰CoA为底物进行聚合反应，以每次循环2个碳的频率合成酰基碳链[7]。而不断地增加酰基碳链与酰基载体蛋白结合，以保护其不受代谢途径中多种酶的侵蚀。一些研究已表明：FAS常为酮酯酰基ACP合成酶，多次反应加碳后，脂肪酸可以在酰基ACP硫酯酶（acyl-ACP thioesterase）或酰基转移酶（acyltransferase）的作用下终止。
ACC酶有2种形式，即多功能酶和多酶复合体，前者被称为真核形式的ACC，而后者被称为原核形式的ACC，原核形式的ACC可以被分为几个多功能的亚基，即生物羧化酶、生物素羧基载体蛋白、羧基转移酶和另一个未知功能的蛋白。在单子叶作物（ 如小麦、玉米和水稻）中的ACC酶为真核形式，这些ACC酶对aryloxy phenoxy propionates和cyclo hexane diones这2种除草剂非常敏感。但是在双子叶植物豌豆和烟草中，ACC为原核形式。Gengenbach等[8]检测了ACC基因在高油黄豆和低油黄豆中的表达量，结果显示，在高油黄豆中ACC基因的表达量是低油黄豆的2倍，特别是在发育的早期和中期，这些结果暗示ACC基因的表达与黄豆脂肪酸的积累具有较高的相关性。Ohlrogge等[9]将油棕种子储藏蛋白的启动子与拟南芥的ACC基因连接，并转化油菜，在T1代，拟南芥的脂肪酸含量增加5.0%～6.4%。Sellwood等[10]通过反义表达技术，抑制ACC基因的表达，转基因植株的含油量显著降低。
参考文献
[1]
BASRI W M，ABDULLAH S N A，HENSON I E.Oil palm：Achievements and potential[J].Plant production science，2005，8（3）：288-297. [2] KOH L P，WILCOVE D S.Cashing in palm oil for conservation[J].Nature，2007，448：993-994.
[3] 李昌珠，李正茂.植物脂肪酸的生物合成及其生理功能的研究進展[J].湖南林业科技，2009，36（6）：45-49.
[4] ASHTON A R，JENKINS C L D，WHITFIELD P R.Molecular cloning of two different cDNAs for malize acetyl CoA carboxylase[J].Plant Mol Biol，1994，24（1）：35-49.
[5] ALBAN C，BALDET P，DOUCE J.Localization and characterization of two structurally different forms of acetylCoA carboxylase in young pea leaves，of which one is sensitive to aryloxyphenoxy propionate herbicides[J].Biochem J，1994，30：557-565.
[6] MORTAZAVI A，WILLIAMS B A，MCCUE K，et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNASeq[J].Nat Methods，2008，5（7）：621-628.
[7] OHLROGGE J，BROWSE J.Lipid biosynthesis[J].Plant cell，1995，7（7）：957-970.
[8] GENGENBACH B G，SOMERS D A，WYSE D L，et al.Transgenic plants expressing maize acetyl CoA carboxylase gene and method of altering oil content：6222099[P].2001-04-24.
[9] OHLROGGE J B，ROESLER K R，SHORROSH B S.Method of increasing oil content of seeds：5925805[P].1999-07-20.
[10] SELLWOOD C，SLABAS A R，RAWSTHORNE S.Effects of manipulating expression of acetyplCoA carboxylasel in Brassica napus L.embryos[J].Biochemical society，2000，28（6）：598-600.