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摘要[目的]克隆夜香树（Cestrum nocturnum L.）萜类香气物质代谢途径关键限速酶DXS2（1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 2）基因全长cDNA，并对该基因进行生物信息学分析，检测该基因在开花不同时间及叶片中表达量的动态变化。[方法]采用RT-PCR与RACE相结合的技术，获得夜香树DXS2的全长核苷酸序列，并进行生物信息学分析，qRT-PCR分析其在盛花期不同时间花和叶中的表达量。[结果]获得CnDXS2基因全长序列2 370 bp，其中ORF 2 145 bp，编码714个氨基酸，含DXP-synthase-N、TPP-PYR-DXS-TK-like和Transketolase-C等保守结构域，与绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis L.）DXS2蛋白同源性达93%，推测属于Ⅱ类DXS蛋白；qRT-PCR分析表明，CnDXS2在叶中表达量总体高于花，花中22∶00表达量最高，14∶00表达量最低，具有节律性。[结论]萜类MEP代谢途径基因CnDXS2的克隆与表达分析为从分子方面揭示CnDXS2基因在萜类香气代谢途径中的功能提供了依据，有助于夜香树花香萜类代谢途径基因功能和花香基因工程的研究。
关键词夜香树；DXS2；表达分析
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2017）10-0132-05
Cloning and Expression Analysis of DXS2 Gene in Cestrum nocturnum L.
LIU Tao，XU Yingyan，XIONG Qing，CHEN Guixing*，SHE Wenqin* et al
（Institute of Storage Science and Technology of Horticultural Products， Fujian Univesity of Agriculture and Forestry， Fuzhou， Fujian 350002）
Abstract[Objective] To clone the fulllength cDNA of a critical rate limiting enzyme gene DXS2 in terpenoids pathway from Cestrum nocturnum L.， analyse bioinformation and qRTPCR of flowers and leaves of different time at blooming stage of the gene. [Method] The fulllength of DXS2 gene was isolated using RTPCR and RACE（rapidamplification of cDNA ends） technology， then analyzed by bioinformatics.The expression of the gene in flower and leaves of different time from blooming stage was analyzed by qRTPCR.[Result] The fulllength of CnDXS2 was 2 370 bp and contained a 2 145 bp open reading frame（ORF） encoding a protein of 714 amino acid， including conserved domains such as DXPsynthaseN， TPPPYRDXSTKlike and TransketolaseC，etc.The homology between CnDXS2 and DXS2 protein from Nicotiana tomentosiformis L. was 93%， maybe a Class Ⅱ DXS protein；qRTPCR analysis showed that the expression level of CnDXS2 in leaves was generally higher than flowers， reached the peak at 22∶00 and lowest at 14∶00 in flowers， with rhythm.[Conclusion] Cloning and expression analysis of CnDXS2 form terpenoid metabolic pathway of MEP can provide the basis to reveal molecular function of CnDXS2 in terpene aroma metabolic pathway， promote the study on the gene function and the floral genetic engineering of terpenoid pathway in C. nocturnum L..
Key wordsCestrum nocturnum L.；DXS2；Expression analysis
夜香树（Cestrum nocturnum L.），茄科（Solanaceae）夜香树属（Cestrum）植物，灌木，廣泛种植于我国南方各地。夜香树花量大，花期长且花香浓郁，具有一定的防蚊虫效果；其管理粗放，繁殖速度快，易于成活；各个部位均可食用或药用，有镇痛、抗肿瘤等功效，在园艺、药用等方面具有较高的潜力[1-4]。在花期，夜香树18∶00至次日6∶00左右完成开花、放香、花瓣闭合等一系列生理活动，浓郁的花香及其不开不香的特性为夜香树等植物所特有。挥发性萜类物质芳樟醇（linalool）、金合欢烯（α-Farnesene）等作为夜香树第二大类花香物质，对于特征香气的构成具有重要作用[5-6]。 DXS作为萜类物质MEP（2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate）代谢途径的第1个限速酶，以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为底物生成DXP，为后续反应提供前体，是萜类物质代谢工程的重要靶点[7-8]。DXS基因最先在大肠杆菌（Escherichia coli）中被分离和鉴定出来[9]，随后，其同源基因相继在拟南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.][10]、胡椒薄荷（Mentha × piperita）[10]等植物中被克隆出来。许多细菌基因组中通常只含有1个DXS基因，高等植物则拥有2个以上编码DXS的基因，在不同组织或者发育阶段起着不同的作用[8，11-12]。目前，DXS基因家族被认为有3类[13-16]：Ⅰ 类参与叶绿体中重要萜类的合成；Ⅱ 类位于非光合作用质体中，参与萜类次生代谢；Ⅲ 类可能参与植物激素等低表达重要萜类的合成。基因工程相关研究发现，超表达DXS基因可提高MEP代谢途径下游产物产量，在拟南芥[17-18]、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）[19]、辣椒（Capsicum annuum L.）[20]等植物中得到证实，异源DXS基因超表达也有相似作用[21]，并可以遗传给下一代且无明显形态、习性变化。
目前，关于夜香树花香分子机制方面的研究相对较少。该研究以夜香树盛花期夜间开放且放香的花朵为材料，通过RT-PCR结合RACE技术，分离了CnDXS2全长cDNA；采用MEGA、WoLF PSORT II 、SignalP等软件对CnDXS2进行了生物信息学分析，为后续试验提供指导；采用qRT-PCR分析CnDXS2在盛花期花和叶中24 h內的表达量变化情况，为弄清CnDXS2在香气代谢方面的作用奠定分子基础，有助于花香基因工程方面研究的进行。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为夜香树盛花期的花和嫩叶，2016年8月取自于福建农林大学材料工程学院前，花和叶从同一侧枝上摘取，18∶00至次日6∶00，每2 h取1次，次日6∶00至次日18∶00每4 h取1次，共9个时间段，每个时间段取3次重复。
试验所需Agarose、GelStain、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity购自北京全式金生物技术有限公司；6×DNA Loading Buffer、pMD18-T Vector、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、RNAiso Plus、SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）购自宝生物工程（大连）有限公司；SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DH5α感受态细胞、Universal DNA 纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其他试剂、耗材均为进口或实验室制备，引物委托上海六合华大公司合成。
1.2方法
1.2.1总RNA提取及cDNA合成。
总RNA提取参照Invitrogen TRIZOL Reagent 说明书操作，沉淀溶于40 μL RNase Free Water；采用紫外分光光度计确定RNA浓度和质量；取800 ng RNA 进行1%琼脂糖凝胶电泳，验证完整性与浓度。RNA检测后立即存于-80 ℃ 备用。cDNA第一链合成参照郑鸿昌[22]、吕恃衡[23]的方法进行。
1.2.2CnDXS2全长的克隆。
根据茄科烟草（Nicotiana tabacum L.）、土豆（Solanum tuberosum L.）、番茄、绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis L.）等植物已公布的DXS2基因序列设计简并引物：CnDXS2_C-F：5′—ATATG（A/C）GGC（A/G）AT（A/G）AAT（A/G）A（C/T）GCAG—3′，CnDXS2_C-R：5′— GCTT（A/C）GTCT（A/C）AT（A/G）GAG（A/G）CAT—3′。PCR扩增体系：10× TransTaq HiFi Buffer Ⅱ 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，TransTaq HiFi DNA Polymerase（5 U/μL）0.25 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，模板0.5 μL，补ddH2O至25 μL；PCR程序参照说明书，设置退火53 ℃，延伸1 min，扩增35个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测特异性后，纯化回收，连接pMD18-T载体再转化至DH5α感受态，得到的菌液采用M13引物进行PCR验证，委托上海六合华大公司进行测序。根据得到的CnDXS2保守区序列，采用Oligo 7设计3′ RACE引物：CnDXS_3RACE-P1：5′—AAGAAGCTGAAATAGACAATAAGA—3′，CnDXS_3RACE-P2：5′—AAGAGGAGTAGATAGCACAGAACG—3′，5′ RACE引物：CnDXS_5RACE-P1：5′—ACCCGACGCGCTAATCATTCC—3′，CnDXS_5RACE-P2：5′—AGGTCCAATTTGCTTTGTTATAC—3′。PCR体系与之前保持不变，PCR程序退火温度根据引物所需温度设置，延伸2 min，其余保持不变，第1轮RACE后PCR产物稀释30～50倍后作为第2轮RACE模板使用。得到的序列使用华大基因自助拼接系统拼接后，采用Vector NTI 11 Align X与接头引物进行比对以去除载体序列。
1.2.3CnDXS2生物信息学分析。
采用NCBI Blast、Blastx对CnDXS2序列进行核酸、氨基酸同源性分析，Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）预测CnDXS2蛋白质基本理化性质，SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测，WoLF PSORT II（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）进行亚细胞定位预测，TMHMM v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白质跨膜结构的预测，采用MEGA 7最大似然法（Maximun Likelihood）进行系统进化分析。 1.2.4qRT-PCR分析。
以得到的序列为模板，利用Beacon Designer 8.14，设置引物Tm （72±5）℃，其他条件参照qRT-PCR引物设计原则进行设置，得到CnDXS2_Q-F：5′— AAGAAGCTGAAATAGACAATAAGA—3′，CnDXS2_Q-R：5′—AAGAGGAGTAGATAGCACAGAACG—3′。
提取9个时间段花和叶的总RNA，根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒说明书，根据SYBR Green qPCR法，取1 μg总RNA进行逆转录，产物稀释20倍后存于-20 ℃；参照说明书设置体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）5 μL，cDNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），补ddH2O至10 μL，每个样品3个复孔；以EF-1A_Q-F：5′—ACTGTTCCTGTCGGTCGTGTTGAGA—3′，EF-1A_Q-R：5′—GGAAGTGCCTCCTGAAGAGCCTCAT—3′为内参引物，参照说明书标准两步法程序，退火温度统一设置为60 ℃，在Bio-Rad CFX96 Touch荧光定量仪上进行qRT-PCR分析。
使用Bio-Rad CFX Manager 3.1 分析CnDXS2相对表达量变化情况，Microsoft Excel 2016绘制柱状图。
2结果与分析
2.1总RNA提取與CnDXS2克隆
由图1可知，使用TRIZOL法提取的RNA，28s、18s条带完整清晰，5s条带隐约可见，28s RNA条带亮度为18s RNA 1～2倍，A260/A230在1.8～2.0，A280/A260在1.9～2.1，符合后续试验要求。
使用设计的简并引物对CnDXS2保守区进行扩增，得到大小为927 bp的片段；使用特异引物对CnDXS2 3′和 5′进行扩增，得到大小分别为952 bp和918 bp的片段；经拼接去除载体片段和重叠区后，得到全长序列2 370 bp，命名为CnDXS2（GenBank登录号：KY628417），Vector NTI 11预测其ORF大小为2 145 bp，编码714个氨基酸。
2.2CnDXS2生物信息学分析
2.2.1序列分析。
由图2可知，经NCBI BlastP在线分析，发现CnDXS2氨基酸含DXP-synthase-N（72～357aa）、TPP-PYR-DXS-TK-like（400～533aa）和Transketolase-C（573～696aa）3个保守结构域，前2个结构域为DXS蛋白典型特征；ProtParam分析其相对分子量为77 007.37 kD，等电点7.17，分子式C3434H5445N947O1009S27，带负电氨基酸总和（Asp + Glu）：74，带正电氨基酸总和（Arg+Lys）：73，稳定系数36.46，属于稳定蛋白，总平均亲水性-0.068，属于亲水性蛋白；WoLF PSORT II预测定位于叶绿体，其次是过氧化物酶体，TaegetP 1.1预测定位于叶绿体（0.262）和线粒体（0.229），与拟南芥DXS2[16]亚细胞定位结果一致；具有转运肽，分裂位点包含36个氨基酸残基，不包含信号肽，这与萜类MEP代谢途径处于质体中的结论相符合；TMHMM预测无跨膜结构，非膜蛋白，整个肽链位于膜外，与DXS基因定位于质体中相符合[24]。
2.2.2系统进化分析。
最大似然法是进行系统进化分析的常用方法之一，在替代模型合适的情况下，ML法拥有较好的效果[25-27]。使用MEGA 7软件[28]对12种茄科植物DXS2基因编码的氨基酸进行系统进化分析，多序列比对采用ClustalW，根据最小BIC（Bayesian Information Criterion）值筛选适合最大似然法的氨基酸替代模型为JTT（Jones-Taylor-Thornton）+G（Gamma distribution），Bootstrap设置为100。由图3可知，在茄科内，夜香树与烟草属植物林烟草、烟草等聚为一支，遗传距离相对较小，亲缘关系近，而与枸杞属（Lycium）、茄属（Solanum）亲缘关系相对较远；节点支持率高，结果具有较高的可信度。
CnDXS2与其他科属13种植物DXS蛋白的系统进化分析如图4所示，筛选出的替代模型同上。在双子叶植物中，夜香树与烟草DXS2蛋白聚为一支，同属DXS2分支，与单子叶植物玉米（Zea mays L.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）以及拟南芥、烟草、玉米DXS蛋白区分开来，说明CnDXS2属于Ⅱ类DXS蛋白的合理性；进化上，推测其同桂花、芝麻、猿麝香亲缘关系较近，同单子叶植物DXS2蛋白亲缘关系最远。
2.3qRT-PCR分析
由图5可知，CnDXS2在夜香树2种组织中均有表达，花中CnDXS2表达量总体低于叶中表达量，随时间变化表现出一定的规律性。花中相对表达量14∶00～22∶00逐渐上调，22∶00至次日14∶00逐渐下调，最大相差3.59倍。叶中相对表达量4∶00～10∶00逐渐下调，10∶00～18∶00迅速上调，18∶00～22∶00急剧下调，22∶00至次日4∶00逐渐上调，最大相差20.8倍。
3讨论与结论
萜类化合物是一类广泛存在于植物的天然化合物，其参与植物生长发育、逆境响应、吸引传粉者等多个方面的生理活动，具有特殊的生态学意义[29]。萜类代谢途径产生的次生代谢物质，以倍半萜种类居多，二萜类以上物质一般不具有挥发性[30-33]。挥发性单萜、倍半萜，如芳樟醇、罗勒烯、金合欢烯等，是花香物质的主要来源，其中，单萜合成的主要途径为MEP代谢途径[7，34-35]。通过超表达代谢途径上游的基因，增加前体合成量，从而提高目的成分的合成是花香基因工程常用的方式之一，超表达DXS、DXR、HMGR等萜类代谢途径关键限速酶可以提高萜类物质的合成量[7，36-38]，但也存在共抑制、其他代谢途径产品增加等问题，需要更进一步的研究。 該研究克隆了夜香树萜类代谢途径关键酶DXS2基因，命名为CnDXS2。生物信息学分析显示，CnDXS2蛋白含有DXS蛋白常见的DXP-synthase-N、TPP-PYR-DXS-TK-like、Transketolase-C保守结构域，说明其在进化中较为保守；理化性质方面，CnDXS2蛋白除理论等电点高于7外，分子量、亲/疏水性、跨膜结构等都与杨滢[39]总结的范围相符合，说明不同植物中DXS蛋白的理化性质较为接近，为后续蛋白性质的分析、分离、定位等提供指导；系统进化分析表明，在茄科中，CnDXS2与茄科烟草属DXS2蛋白亲缘关系较近，在植物DXS蛋白中，与双子叶植物DXS2聚为一类，可能属于Ⅱ类DXS蛋白，亲缘关系上与同为唇形目桂花、芝麻DXS2等较为接近。从表达量来看，CnDXS2在花中的表达量夜间明显高于白天，在22∶00表达量最高，与MEP代谢途径下游基因CnLIS表达高峰以及大致趋势接近，具有节律性，同为夜间放香的茉莉[Jasminum sambac（L.）Ait]JsDXS[40]具有相似的表达趋势，也符合吕恃衡[23]得出的花香在8∶00～11∶00最浓的结论，推测其变化可能与花香的夜间释放有关；叶中表达量总体上高于花中表达量，可能与叶绿体含量高有关[41]，表达量呈现较为明显的波动情况，可能存在光[42]、生物钟[43]等其他控制因素，还有待于进一步研究。
目前，关于DXS基因家族的研究以DXS1居多，DXS2时间表达及功能、调控的研究相对较少。表达量在空间上以嫩叶[44-45]、花[46]居多；时间上呈现节律性，如桂花OfDXS2[46]。基因功能上，拟南芥DXS2（DXL1）[16]被证明对生长发育影响不大，番茄DXS2[45]影响腺毛密度，调节前体在代谢途径间的分配等，在不同植物中具有特殊作用。CnDXS2是否具有新的功能以及是否能在花香基因工程中起重要作用，仍需要后续研究。
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Abstract[Objective] To clone the fulllength cDNA of a critical rate limiting enzyme gene DXS2 in terpenoids pathway from Cestrum nocturnum L.， analyse bioinformation and qRTPCR of flowers and leaves of different time at blooming stage of the gene. [Method] The fulllength of DXS2 gene was isolated using RTPCR and RACE（rapidamplification of cDNA ends） technology， then analyzed by bioinformatics.The expression of the gene in flower and leaves of different time from blooming stage was analyzed by qRTPCR.[Result] The fulllength of CnDXS2 was 2 370 bp and contained a 2 145 bp open reading frame（ORF） encoding a protein of 714 amino acid， including conserved domains such as DXPsynthaseN， TPPPYRDXSTKlike and TransketolaseC，etc.The homology between CnDXS2 and DXS2 protein from Nicotiana tomentosiformis L. was 93%， maybe a Class Ⅱ DXS protein；qRTPCR analysis showed that the expression level of CnDXS2 in leaves was generally higher than flowers， reached the peak at 22∶00 and lowest at 14∶00 in flowers， with rhythm.[Conclusion] Cloning and expression analysis of CnDXS2 form terpenoid metabolic pathway of MEP can provide the basis to reveal molecular function of CnDXS2 in terpene aroma metabolic pathway， promote the study on the gene function and the floral genetic engineering of terpenoid pathway in C. nocturnum L..
Key wordsCestrum nocturnum L.；DXS2；Expression analysis
夜香树（Cestrum nocturnum L.），茄科（Solanaceae）夜香树属（Cestrum）植物，灌木，廣泛种植于我国南方各地。夜香树花量大，花期长且花香浓郁，具有一定的防蚊虫效果；其管理粗放，繁殖速度快，易于成活；各个部位均可食用或药用，有镇痛、抗肿瘤等功效，在园艺、药用等方面具有较高的潜力[1-4]。在花期，夜香树18∶00至次日6∶00左右完成开花、放香、花瓣闭合等一系列生理活动，浓郁的花香及其不开不香的特性为夜香树等植物所特有。挥发性萜类物质芳樟醇（linalool）、金合欢烯（α-Farnesene）等作为夜香树第二大类花香物质，对于特征香气的构成具有重要作用[5-6]。 DXS作为萜类物质MEP（2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate）代谢途径的第1个限速酶，以丙酮酸和3-磷酸甘油醛为底物生成DXP，为后续反应提供前体，是萜类物质代谢工程的重要靶点[7-8]。DXS基因最先在大肠杆菌（Escherichia coli）中被分离和鉴定出来[9]，随后，其同源基因相继在拟南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.][10]、胡椒薄荷（Mentha × piperita）[10]等植物中被克隆出来。许多细菌基因组中通常只含有1个DXS基因，高等植物则拥有2个以上编码DXS的基因，在不同组织或者发育阶段起着不同的作用[8，11-12]。目前，DXS基因家族被认为有3类[13-16]：Ⅰ 类参与叶绿体中重要萜类的合成；Ⅱ 类位于非光合作用质体中，参与萜类次生代谢；Ⅲ 类可能参与植物激素等低表达重要萜类的合成。基因工程相关研究发现，超表达DXS基因可提高MEP代谢途径下游产物产量，在拟南芥[17-18]、番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）[19]、辣椒（Capsicum annuum L.）[20]等植物中得到证实，异源DXS基因超表达也有相似作用[21]，并可以遗传给下一代且无明显形态、习性变化。
目前，关于夜香树花香分子机制方面的研究相对较少。该研究以夜香树盛花期夜间开放且放香的花朵为材料，通过RT-PCR结合RACE技术，分离了CnDXS2全长cDNA；采用MEGA、WoLF PSORT II 、SignalP等软件对CnDXS2进行了生物信息学分析，为后续试验提供指导；采用qRT-PCR分析CnDXS2在盛花期花和叶中24 h內的表达量变化情况，为弄清CnDXS2在香气代谢方面的作用奠定分子基础，有助于花香基因工程方面研究的进行。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为夜香树盛花期的花和嫩叶，2016年8月取自于福建农林大学材料工程学院前，花和叶从同一侧枝上摘取，18∶00至次日6∶00，每2 h取1次，次日6∶00至次日18∶00每4 h取1次，共9个时间段，每个时间段取3次重复。
试验所需Agarose、GelStain、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity购自北京全式金生物技术有限公司；6×DNA Loading Buffer、pMD18-T Vector、PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）、RNAiso Plus、SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）购自宝生物工程（大连）有限公司；SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；DH5α感受态细胞、Universal DNA 纯化回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其他试剂、耗材均为进口或实验室制备，引物委托上海六合华大公司合成。
1.2方法
1.2.1总RNA提取及cDNA合成。
总RNA提取参照Invitrogen TRIZOL Reagent 说明书操作，沉淀溶于40 μL RNase Free Water；采用紫外分光光度计确定RNA浓度和质量；取800 ng RNA 进行1%琼脂糖凝胶电泳，验证完整性与浓度。RNA检测后立即存于-80 ℃ 备用。cDNA第一链合成参照郑鸿昌[22]、吕恃衡[23]的方法进行。
1.2.2CnDXS2全长的克隆。
根据茄科烟草（Nicotiana tabacum L.）、土豆（Solanum tuberosum L.）、番茄、绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis L.）等植物已公布的DXS2基因序列设计简并引物：CnDXS2_C-F：5′—ATATG（A/C）GGC（A/G）AT（A/G）AAT（A/G）A（C/T）GCAG—3′，CnDXS2_C-R：5′— GCTT（A/C）GTCT（A/C）AT（A/G）GAG（A/G）CAT—3′。PCR扩增体系：10× TransTaq HiFi Buffer Ⅱ 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，TransTaq HiFi DNA Polymerase（5 U/μL）0.25 μL，上下游引物（10 μmol/μL）各0.5 μL，模板0.5 μL，补ddH2O至25 μL；PCR程序参照说明书，设置退火53 ℃，延伸1 min，扩增35个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测特异性后，纯化回收，连接pMD18-T载体再转化至DH5α感受态，得到的菌液采用M13引物进行PCR验证，委托上海六合华大公司进行测序。根据得到的CnDXS2保守区序列，采用Oligo 7设计3′ RACE引物：CnDXS_3RACE-P1：5′—AAGAAGCTGAAATAGACAATAAGA—3′，CnDXS_3RACE-P2：5′—AAGAGGAGTAGATAGCACAGAACG—3′，5′ RACE引物：CnDXS_5RACE-P1：5′—ACCCGACGCGCTAATCATTCC—3′，CnDXS_5RACE-P2：5′—AGGTCCAATTTGCTTTGTTATAC—3′。PCR体系与之前保持不变，PCR程序退火温度根据引物所需温度设置，延伸2 min，其余保持不变，第1轮RACE后PCR产物稀释30～50倍后作为第2轮RACE模板使用。得到的序列使用华大基因自助拼接系统拼接后，采用Vector NTI 11 Align X与接头引物进行比对以去除载体序列。
1.2.3CnDXS2生物信息学分析。
采用NCBI Blast、Blastx对CnDXS2序列进行核酸、氨基酸同源性分析，Protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）预测CnDXS2蛋白质基本理化性质，SignalP 4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测，WoLF PSORT II（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）进行亚细胞定位预测，TMHMM v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）进行蛋白质跨膜结构的预测，采用MEGA 7最大似然法（Maximun Likelihood）进行系统进化分析。 1.2.4qRT-PCR分析。
以得到的序列为模板，利用Beacon Designer 8.14，设置引物Tm （72±5）℃，其他条件参照qRT-PCR引物设计原则进行设置，得到CnDXS2_Q-F：5′— AAGAAGCTGAAATAGACAATAAGA—3′，CnDXS2_Q-R：5′—AAGAGGAGTAGATAGCACAGAACG—3′。
提取9个时间段花和叶的总RNA，根据PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）试剂盒说明书，根据SYBR Green qPCR法，取1 μg总RNA进行逆转录，产物稀释20倍后存于-20 ℃；参照说明书设置体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2×）5 μL，cDNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），补ddH2O至10 μL，每个样品3个复孔；以EF-1A_Q-F：5′—ACTGTTCCTGTCGGTCGTGTTGAGA—3′，EF-1A_Q-R：5′—GGAAGTGCCTCCTGAAGAGCCTCAT—3′为内参引物，参照说明书标准两步法程序，退火温度统一设置为60 ℃，在Bio-Rad CFX96 Touch荧光定量仪上进行qRT-PCR分析。
使用Bio-Rad CFX Manager 3.1 分析CnDXS2相对表达量变化情况，Microsoft Excel 2016绘制柱状图。
2结果与分析
2.1总RNA提取與CnDXS2克隆
由图1可知，使用TRIZOL法提取的RNA，28s、18s条带完整清晰，5s条带隐约可见，28s RNA条带亮度为18s RNA 1～2倍，A260/A230在1.8～2.0，A280/A260在1.9～2.1，符合后续试验要求。
使用设计的简并引物对CnDXS2保守区进行扩增，得到大小为927 bp的片段；使用特异引物对CnDXS2 3′和 5′进行扩增，得到大小分别为952 bp和918 bp的片段；经拼接去除载体片段和重叠区后，得到全长序列2 370 bp，命名为CnDXS2（GenBank登录号：KY628417），Vector NTI 11预测其ORF大小为2 145 bp，编码714个氨基酸。
2.2CnDXS2生物信息学分析
2.2.1序列分析。
由图2可知，经NCBI BlastP在线分析，发现CnDXS2氨基酸含DXP-synthase-N（72～357aa）、TPP-PYR-DXS-TK-like（400～533aa）和Transketolase-C（573～696aa）3个保守结构域，前2个结构域为DXS蛋白典型特征；ProtParam分析其相对分子量为77 007.37 kD，等电点7.17，分子式C3434H5445N947O1009S27，带负电氨基酸总和（Asp + Glu）：74，带正电氨基酸总和（Arg+Lys）：73，稳定系数36.46，属于稳定蛋白，总平均亲水性-0.068，属于亲水性蛋白；WoLF PSORT II预测定位于叶绿体，其次是过氧化物酶体，TaegetP 1.1预测定位于叶绿体（0.262）和线粒体（0.229），与拟南芥DXS2[16]亚细胞定位结果一致；具有转运肽，分裂位点包含36个氨基酸残基，不包含信号肽，这与萜类MEP代谢途径处于质体中的结论相符合；TMHMM预测无跨膜结构，非膜蛋白，整个肽链位于膜外，与DXS基因定位于质体中相符合[24]。
2.2.2系统进化分析。
最大似然法是进行系统进化分析的常用方法之一，在替代模型合适的情况下，ML法拥有较好的效果[25-27]。使用MEGA 7软件[28]对12种茄科植物DXS2基因编码的氨基酸进行系统进化分析，多序列比对采用ClustalW，根据最小BIC（Bayesian Information Criterion）值筛选适合最大似然法的氨基酸替代模型为JTT（Jones-Taylor-Thornton）+G（Gamma distribution），Bootstrap设置为100。由图3可知，在茄科内，夜香树与烟草属植物林烟草、烟草等聚为一支，遗传距离相对较小，亲缘关系近，而与枸杞属（Lycium）、茄属（Solanum）亲缘关系相对较远；节点支持率高，结果具有较高的可信度。
CnDXS2与其他科属13种植物DXS蛋白的系统进化分析如图4所示，筛选出的替代模型同上。在双子叶植物中，夜香树与烟草DXS2蛋白聚为一支，同属DXS2分支，与单子叶植物玉米（Zea mays L.）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）以及拟南芥、烟草、玉米DXS蛋白区分开来，说明CnDXS2属于Ⅱ类DXS蛋白的合理性；进化上，推测其同桂花、芝麻、猿麝香亲缘关系较近，同单子叶植物DXS2蛋白亲缘关系最远。
2.3qRT-PCR分析
由图5可知，CnDXS2在夜香树2种组织中均有表达，花中CnDXS2表达量总体低于叶中表达量，随时间变化表现出一定的规律性。花中相对表达量14∶00～22∶00逐渐上调，22∶00至次日14∶00逐渐下调，最大相差3.59倍。叶中相对表达量4∶00～10∶00逐渐下调，10∶00～18∶00迅速上调，18∶00～22∶00急剧下调，22∶00至次日4∶00逐渐上调，最大相差20.8倍。
3讨论与结论
萜类化合物是一类广泛存在于植物的天然化合物，其参与植物生长发育、逆境响应、吸引传粉者等多个方面的生理活动，具有特殊的生态学意义[29]。萜类代谢途径产生的次生代谢物质，以倍半萜种类居多，二萜类以上物质一般不具有挥发性[30-33]。挥发性单萜、倍半萜，如芳樟醇、罗勒烯、金合欢烯等，是花香物质的主要来源，其中，单萜合成的主要途径为MEP代谢途径[7，34-35]。通过超表达代谢途径上游的基因，增加前体合成量，从而提高目的成分的合成是花香基因工程常用的方式之一，超表达DXS、DXR、HMGR等萜类代谢途径关键限速酶可以提高萜类物质的合成量[7，36-38]，但也存在共抑制、其他代谢途径产品增加等问题，需要更进一步的研究。 該研究克隆了夜香树萜类代谢途径关键酶DXS2基因，命名为CnDXS2。生物信息学分析显示，CnDXS2蛋白含有DXS蛋白常见的DXP-synthase-N、TPP-PYR-DXS-TK-like、Transketolase-C保守结构域，说明其在进化中较为保守；理化性质方面，CnDXS2蛋白除理论等电点高于7外，分子量、亲/疏水性、跨膜结构等都与杨滢[39]总结的范围相符合，说明不同植物中DXS蛋白的理化性质较为接近，为后续蛋白性质的分析、分离、定位等提供指导；系统进化分析表明，在茄科中，CnDXS2与茄科烟草属DXS2蛋白亲缘关系较近，在植物DXS蛋白中，与双子叶植物DXS2聚为一类，可能属于Ⅱ类DXS蛋白，亲缘关系上与同为唇形目桂花、芝麻DXS2等较为接近。从表达量来看，CnDXS2在花中的表达量夜间明显高于白天，在22∶00表达量最高，与MEP代谢途径下游基因CnLIS表达高峰以及大致趋势接近，具有节律性，同为夜间放香的茉莉[Jasminum sambac（L.）Ait]JsDXS[40]具有相似的表达趋势，也符合吕恃衡[23]得出的花香在8∶00～11∶00最浓的结论，推测其变化可能与花香的夜间释放有关；叶中表达量总体上高于花中表达量，可能与叶绿体含量高有关[41]，表达量呈现较为明显的波动情况，可能存在光[42]、生物钟[43]等其他控制因素，还有待于进一步研究。
目前，关于DXS基因家族的研究以DXS1居多，DXS2时间表达及功能、调控的研究相对较少。表达量在空间上以嫩叶[44-45]、花[46]居多；时间上呈现节律性，如桂花OfDXS2[46]。基因功能上，拟南芥DXS2（DXL1）[16]被证明对生长发育影响不大，番茄DXS2[45]影响腺毛密度，调节前体在代谢途径间的分配等，在不同植物中具有特殊作用。CnDXS2是否具有新的功能以及是否能在花香基因工程中起重要作用，仍需要后续研究。
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