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摘要：目的：对注射用蜂毒制剂中蜂毒肽及蜂毒明肽的含量HPLC检测方法的建立及验证。方法：采用高效液相色谱法，以C8色谱柱，进行不同液相条件洗脱检测，确定方法后进行方法学研究。结果：建立了适宜的HPLC检测方法，并完成了方法验证。结论：本研究结果确定了注射用蜂毒制剂中蜂毒肽及蜂毒明肽的含量HPLC检测方法。
关键词：蜂毒肽;蜂毒明肽;HPLC检测方法
Abstract： Objective：To establish and verify an HPLC method for the determination of melittin andapamin in bee venom preparations for injection. Methods：High Performance Liquid Chromatography with C8 column was used for elution detection under different liquid conditions. After the method was determined， the methodology was studied. Results： A suitable HPLC method was established and verified. Conclusion：The results of this study determined the HPLC method for the determination of melittin andapamin in bee venom preparations for injection.
Key words： Melittin; Apamin; HPLC method
【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）07--02
蜜蜂毒是蜜蜂科昆虫中华蜜蜂或意大利蜜蜂尾部蛰刺腺内的有毒液体，性味辛苦，平，功效祛风湿，止疼痛。主治风湿性关节炎，腰肌酸痛，坐骨神经痛[1]。蜜蜂毒中含有多种不同化学结构的生物活性物质，主要有：蜂毒素（Melittin），蜂毒明肽（apamin），MCD-肽（mast cell degranulating peptide），心脏肽（cardiopeptide），含组胺肽（histapeptide），赛卡平（secapin），托肽平（tertiapin）、阿度拉平（adolapin）等，此外还含有组胺，磷脂酶 A2及透明质酸酶等[2]。
以 HPLC 法测定提取物中蜂毒素的含量，方法准确、简便、重现性好、灵敏度高，可为蜂毒素产品质量标准制定提供可靠的依据，因此建立了注射用蜂毒制剂中蜂毒肽、蜂毒明肽含量测定的方法。注射用蜂毒一般使用指纹图谱方法进行质量研究，使用该方法用于定量测定时，蜂毒肽及蜂毒明肽与其周围杂质分离较差，故需重新确定检测方法。液相方法检测注射用蜂毒时，噪音较大，使得蜂毒肽及蜂毒明肽的定量限较高，因此需要提高样品溶液的浓度进行检测。
1、仪器及试剂
2、HPLC分析方法的确定
通过查阅相关文献[3]，现有HPLC方法确定为：照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）试验，色谱柱为Zorbax 300 SB C8（250mm×4.6mm，5?m）;柱温35℃;以0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B;流速为每分钟1mL;按下表进行梯度洗脱;检测波长为220nm;进样量10?l。，梯度程序如下：
2.1三氟乙酸（TFA）用量
在现有方法的基础上修改流动相中TFA的比例，分别以0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的TFA水溶液作为流动相A，以乙腈为流動相B，注射用蜂毒样品进行HPLC检测。结果如图所示：
结果表明，0.20%的TFA水溶液作为流动相A进行液相分离的效果最好。
2.2梯度的选择：
在原有液相方法梯度基础上，设计了一系列的液相色谱梯度，对注射用蜂毒样品进行了测定，结果如图：
经不同流动相梯度研究，最终确定为梯度9作为最终的HPLC检测方法，在该梯度的流动相检测条件下，蜂毒肽及蜂毒明肽的分离效果最好。
2.3流速
在确定了检测梯度的条件下，分别以0.95mL/min，1.00mL/min，1.05mL/min的流速进行了研究，结果如图：
2.4柱温
分别将柱温设置为30℃、35℃、40℃，进行了测定，结果如图：
2.5样品浓度选择
在该检测方法检测注射用蜂毒中蜂毒肽及蜂毒明肽的含量时，蜂毒肽计算较为准确，但蜂毒明肽灵敏度较低，故提高了样品的配置浓度，最终确定了样品的溶解浓度为5mg/mL，用以测定蜂毒明肽的含量，再稀释之约为1mg/mL的浓度，用以测定蜂毒肽的含量。其对应的对照品浓度为0.2mg/mL的蜂毒明肽对照品和1.0mg/mL的蜂毒肽对照品。
2.6结果
最终确定了注射用蜂毒中蜂毒肽及蜂毒明肽的HPLC测定含量的方法为：
照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）试验，色谱柱为Zorbax 300 SB C8（250mm×4.6mm，5?m）;柱温35℃;以0.2%三氟乙酸（TFA）水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B;流速为每分钟1mL;按下表进行梯度洗脱;检测波长为220nm;进样量20?l。，梯度程序如下： 3、HPLC检测方法的方法学验证。
参考《中国药典》2020版，9101 分析方法验证指导原则，验证的指标有：专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。
3.1专属性：
溶剂空白：水。
辅料空白：按照配方，称取KH2PO4、甘露醇、NaOH配置成浓度分别为13.6mg/mL 、20mg/mL、1.2mg/mL的水溶液。
对照品溶液：称取蜂毒明肽对照品和取蜂毒肽对照品配置成浓度分为0.04mg/mL和1mg/mL的水溶液。
按上述方法进行试验，分别取溶剂空白、辅料空白、样品，进样20?L，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图：
空白溶液及辅料不干扰注射用蜂毒样品的测定;3min之前的峰为溶剂峰，80min之后为梯度交换峰，本方法具有较好的专属性。
3.2准确度
精密称取蜂毒肽及蜂毒明肽对照品适量，按比例加入空白辅料，用水解并定量稀释制成80%、100%、120%浓度的溶液各三份，进HPLC检测，结果在80%到120%浓度范围内，蜂毒肽回收率在98.85%到 101.3%之間，RSD%为0.87%;蜂毒明肽回收率则在98.39%到 101.3%之间，RSD%为0.98%。表明该液相方法的准确度符合要求。
3.3精密度
用DMG0201批注射用蜂毒平行配制样品6份，测定该方法的重复性，结果表明，连续测定六次该批次样品，结果蜂毒肽及蜂毒明肽含量的RSD%分别为0.28%，0.30%。
另更换实验人员、日期及仪器，重新测定其中间精密度，结果综合两次共12次测定数据，蜂毒肽及蜂毒明肽含量的RSD%分别为1.24%，1.25%。
3.4检测限、定量限
分别精密称取蜂毒肽和蜂毒明肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成10μg/mL的溶液作为LOQ溶液，在定量稀释至5μg/mL作为LOD溶液，进HPLC检测。另取纯水，进HPLC检测，作为空白噪音，结果见下表：
3.5线性及范围
精密称取蜂毒肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成一系列浓度（100、200、500、800、1000、1200、2000μg/mL）的溶液，进HPLC检测，以质量浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性拟合，线性方程为A=12563c-4429，R2=0.9997。
另精密称取蜂毒明肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成一系列浓度（50、125、200、250、300、375、500μg/mL）的溶液，进HPLC检测，以质量浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性拟合，线性方程为A=6875c-9189，R2=0.9999。
3.6稳定性
精密称取蜂毒肽及蜂毒明肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成1mg/mL及25μg/mL的溶液，每隔一段时间，取20μL进HPLC检测。结果在24h内，蜂毒肽RD%相对0h峰面积不超过0.97%，蜂毒明肽相对0h峰面积RD%不超过1.89%，说明二者在24h内均保持稳定。
3.7耐用性
耐用性试验分别测定了HPLC参数（检测波长、流速、柱温、流动相初始比例、流动相A中三氟乙酸的量）微小变化时，该方法的耐用性。
调整HPLC参数，于不同条件下对注射用蜂毒样品进行检测，结果当波长。
HPLC参数发生改变时，测定同一批次的样品，其蜂毒肽与蜂毒明肽RSD%均不大于2.0%。
4、注射用蜂毒样品检测
取注射用蜂毒三个批号产品DMG0201、EMG0202、FMG0203，用建立的HPLC检测方法对其进行定量测定，结果三批样品中蜂毒肽相对标示量分别为81.03%，75.01%，81.77%;蜂毒明肽相对标示量分别为3.77%，3.42%，3.57%。
结论：实验以原有指纹图谱检测方法为基础，重新优化建立了用以定量检测注射用蜂毒中蜂毒肽和蜂毒明肽含量的HPLC检测方法。本方法以注射用蜂毒为研究样品，从样品整体性质的角度进行分离分析，方法学验证表明，本方法专属性强，重复性、耐用性良好，可以用于控制注射用蜂毒工艺与质量。
参考文献：
[1] F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，等精编分子生物学实验指南[M]. 科学出版社 1998， 338.
[2] 汪家政，范明. 蛋白质技术手册[M]. 科学出版社 2000， 257.
[3] 孟迂 我国产意大利蜂蜂毒多肽的分离纯化、结构鉴定、活性测定以及固相合成研究 博士学位论文，北京协和医学院研究生院.
关键词：蜂毒肽;蜂毒明肽;HPLC检测方法
Abstract： Objective：To establish and verify an HPLC method for the determination of melittin andapamin in bee venom preparations for injection. Methods：High Performance Liquid Chromatography with C8 column was used for elution detection under different liquid conditions. After the method was determined， the methodology was studied. Results： A suitable HPLC method was established and verified. Conclusion：The results of this study determined the HPLC method for the determination of melittin andapamin in bee venom preparations for injection.
Key words： Melittin; Apamin; HPLC method
【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】2107-2306（2021）07--02
蜜蜂毒是蜜蜂科昆虫中华蜜蜂或意大利蜜蜂尾部蛰刺腺内的有毒液体，性味辛苦，平，功效祛风湿，止疼痛。主治风湿性关节炎，腰肌酸痛，坐骨神经痛[1]。蜜蜂毒中含有多种不同化学结构的生物活性物质，主要有：蜂毒素（Melittin），蜂毒明肽（apamin），MCD-肽（mast cell degranulating peptide），心脏肽（cardiopeptide），含组胺肽（histapeptide），赛卡平（secapin），托肽平（tertiapin）、阿度拉平（adolapin）等，此外还含有组胺，磷脂酶 A2及透明质酸酶等[2]。
以 HPLC 法测定提取物中蜂毒素的含量，方法准确、简便、重现性好、灵敏度高，可为蜂毒素产品质量标准制定提供可靠的依据，因此建立了注射用蜂毒制剂中蜂毒肽、蜂毒明肽含量测定的方法。注射用蜂毒一般使用指纹图谱方法进行质量研究，使用该方法用于定量测定时，蜂毒肽及蜂毒明肽与其周围杂质分离较差，故需重新确定检测方法。液相方法检测注射用蜂毒时，噪音较大，使得蜂毒肽及蜂毒明肽的定量限较高，因此需要提高样品溶液的浓度进行检测。
1、仪器及试剂
2、HPLC分析方法的确定
通过查阅相关文献[3]，现有HPLC方法确定为：照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）试验，色谱柱为Zorbax 300 SB C8（250mm×4.6mm，5?m）;柱温35℃;以0.1%三氟乙酸（TFA）水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B;流速为每分钟1mL;按下表进行梯度洗脱;检测波长为220nm;进样量10?l。，梯度程序如下：
2.1三氟乙酸（TFA）用量
在现有方法的基础上修改流动相中TFA的比例，分别以0.05%、0.10%、0.15%、0.20%的TFA水溶液作为流动相A，以乙腈为流動相B，注射用蜂毒样品进行HPLC检测。结果如图所示：
结果表明，0.20%的TFA水溶液作为流动相A进行液相分离的效果最好。
2.2梯度的选择：
在原有液相方法梯度基础上，设计了一系列的液相色谱梯度，对注射用蜂毒样品进行了测定，结果如图：
经不同流动相梯度研究，最终确定为梯度9作为最终的HPLC检测方法，在该梯度的流动相检测条件下，蜂毒肽及蜂毒明肽的分离效果最好。
2.3流速
在确定了检测梯度的条件下，分别以0.95mL/min，1.00mL/min，1.05mL/min的流速进行了研究，结果如图：
2.4柱温
分别将柱温设置为30℃、35℃、40℃，进行了测定，结果如图：
2.5样品浓度选择
在该检测方法检测注射用蜂毒中蜂毒肽及蜂毒明肽的含量时，蜂毒肽计算较为准确，但蜂毒明肽灵敏度较低，故提高了样品的配置浓度，最终确定了样品的溶解浓度为5mg/mL，用以测定蜂毒明肽的含量，再稀释之约为1mg/mL的浓度，用以测定蜂毒肽的含量。其对应的对照品浓度为0.2mg/mL的蜂毒明肽对照品和1.0mg/mL的蜂毒肽对照品。
2.6结果
最终确定了注射用蜂毒中蜂毒肽及蜂毒明肽的HPLC测定含量的方法为：
照高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）试验，色谱柱为Zorbax 300 SB C8（250mm×4.6mm，5?m）;柱温35℃;以0.2%三氟乙酸（TFA）水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B;流速为每分钟1mL;按下表进行梯度洗脱;检测波长为220nm;进样量20?l。，梯度程序如下： 3、HPLC检测方法的方法学验证。
参考《中国药典》2020版，9101 分析方法验证指导原则，验证的指标有：专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度）、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。
3.1专属性：
溶剂空白：水。
辅料空白：按照配方，称取KH2PO4、甘露醇、NaOH配置成浓度分别为13.6mg/mL 、20mg/mL、1.2mg/mL的水溶液。
对照品溶液：称取蜂毒明肽对照品和取蜂毒肽对照品配置成浓度分为0.04mg/mL和1mg/mL的水溶液。
按上述方法进行试验，分别取溶剂空白、辅料空白、样品，进样20?L，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果如图：
空白溶液及辅料不干扰注射用蜂毒样品的测定;3min之前的峰为溶剂峰，80min之后为梯度交换峰，本方法具有较好的专属性。
3.2准确度
精密称取蜂毒肽及蜂毒明肽对照品适量，按比例加入空白辅料，用水解并定量稀释制成80%、100%、120%浓度的溶液各三份，进HPLC检测，结果在80%到120%浓度范围内，蜂毒肽回收率在98.85%到 101.3%之間，RSD%为0.87%;蜂毒明肽回收率则在98.39%到 101.3%之间，RSD%为0.98%。表明该液相方法的准确度符合要求。
3.3精密度
用DMG0201批注射用蜂毒平行配制样品6份，测定该方法的重复性，结果表明，连续测定六次该批次样品，结果蜂毒肽及蜂毒明肽含量的RSD%分别为0.28%，0.30%。
另更换实验人员、日期及仪器，重新测定其中间精密度，结果综合两次共12次测定数据，蜂毒肽及蜂毒明肽含量的RSD%分别为1.24%，1.25%。
3.4检测限、定量限
分别精密称取蜂毒肽和蜂毒明肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成10μg/mL的溶液作为LOQ溶液，在定量稀释至5μg/mL作为LOD溶液，进HPLC检测。另取纯水，进HPLC检测，作为空白噪音，结果见下表：
3.5线性及范围
精密称取蜂毒肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成一系列浓度（100、200、500、800、1000、1200、2000μg/mL）的溶液，进HPLC检测，以质量浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性拟合，线性方程为A=12563c-4429，R2=0.9997。
另精密称取蜂毒明肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成一系列浓度（50、125、200、250、300、375、500μg/mL）的溶液，进HPLC检测，以质量浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性拟合，线性方程为A=6875c-9189，R2=0.9999。
3.6稳定性
精密称取蜂毒肽及蜂毒明肽对照品适量，用水溶解并定量稀释制成1mg/mL及25μg/mL的溶液，每隔一段时间，取20μL进HPLC检测。结果在24h内，蜂毒肽RD%相对0h峰面积不超过0.97%，蜂毒明肽相对0h峰面积RD%不超过1.89%，说明二者在24h内均保持稳定。
3.7耐用性
耐用性试验分别测定了HPLC参数（检测波长、流速、柱温、流动相初始比例、流动相A中三氟乙酸的量）微小变化时，该方法的耐用性。
调整HPLC参数，于不同条件下对注射用蜂毒样品进行检测，结果当波长。
HPLC参数发生改变时，测定同一批次的样品，其蜂毒肽与蜂毒明肽RSD%均不大于2.0%。
4、注射用蜂毒样品检测
取注射用蜂毒三个批号产品DMG0201、EMG0202、FMG0203，用建立的HPLC检测方法对其进行定量测定，结果三批样品中蜂毒肽相对标示量分别为81.03%，75.01%，81.77%;蜂毒明肽相对标示量分别为3.77%，3.42%，3.57%。
结论：实验以原有指纹图谱检测方法为基础，重新优化建立了用以定量检测注射用蜂毒中蜂毒肽和蜂毒明肽含量的HPLC检测方法。本方法以注射用蜂毒为研究样品，从样品整体性质的角度进行分离分析，方法学验证表明，本方法专属性强，重复性、耐用性良好，可以用于控制注射用蜂毒工艺与质量。
参考文献：
[1] F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，等精编分子生物学实验指南[M]. 科学出版社 1998， 338.
[2] 汪家政，范明. 蛋白质技术手册[M]. 科学出版社 2000， 257.
[3] 孟迂 我国产意大利蜂蜂毒多肽的分离纯化、结构鉴定、活性测定以及固相合成研究 博士学位论文，北京协和医学院研究生院.