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[摘要] 目的 探讨斑贞1号、川芎嗪和5-氟尿嘧啶联合逆转人胃癌细胞系SGC-7901/ADR与谷胱甘肽S-转移酶表达的相关性。方法 采用半定量逆转录聚合酶链反应比较人胃癌细胞SGC-7901/ADR细胞在单纯5-FU和5-FU联合斑贞1号及TMP处理组GST-πmRNA的表达情况。结果 5-FU组与阴性对照组相比，GST-πmRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05），而5-FU联合斑贞1号及TMP处理组GST-πmRNA表达量明显降低（P＜0.05）。 结论 斑贞1号、TMP和5-FU联合逆转SGC-7901/ADR细胞耐药性可能与GST-π相关，为当前胃癌的治疗提供新的理论依据。
[关键词] 胃癌； 斑贞1号； TMP； 5-FU； GST-π
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）04-34-02
Banzhen 1，Tetra methylpyrazine and 5-fluorouracil effect on human gastric cancer cells Glutathione-S-transferase
FU Guizhen1 ZHANG Aimin2
1.Department of Internal Medicine,Huade County Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Huade 013350, China; 2.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, China
[Abstract] Objective To explore of the correlativity between Banzhen 1, Tetra methylpyrazine and 5-fluorouracil reversing human gastric cancer cell line SGC-7901/ADR with Glutathione-s-transferase expressions. Methods Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction was used for comparison of GST-πmRNA expression for cell line SGC-7901/ADR in group of 5-FU，5-FU and Banzhen 1,TMP. Results The expression of GST-πmRNA between the 5-FU group and the control group，there was no significant differences (P＞ 0.05)， while 5-Fu and Banzhen 1 group and TMP group was decreased significantly(P＜0.05). Conclusion It is possible correlated to GST-π for Banzhen 1，TMP and 5-FU reversed multidrug resistance in human gastric cancer cells，which may supply a new theoretical basis for the clinical effective treatment of gastric carcinoma.
[Key words] Stomach cancer; Banzhen 1;TMP; 5-FU; GST-π
化療是治疗胃癌的有效手段之一，但胃癌多药耐药性（MDR）是导致化疗失败的主要原因。近几年发现GST-π在胃癌多药耐药性方面起着重要作用，本课题先前已证实斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞有较强的逆转作用[1]。因此，笔者在此实验的基础上，通过检测不同药物组GST-πmRNA的表达量从分子生物的角度进一步探讨斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞的作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞系
耐阿霉素人胃癌细胞株SGC-7901/ADR细胞，西京医院消化研究所提供。
1.2 药物、试剂及主要仪器
斑贞1号由斑蝥、露蜂房、女贞子、山茱萸按一定比例组成，包头医学院第一附属医院制备，每毫升含原生药0.2 g，4℃保存。TMP、5-FU （南通精华制药有限公司），RPMI1640（美国GIBCO公司产品），新生小牛血清（赛默飞世尔生物化学制造）、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（美国Sigma公司），RT-PCR试剂盒及Trizol（TakaRa公司），引物（上海生工生物工程有限公司），PCR扩增仪（美国AB公司）、电泳仪（DF-D，北京）、紫外分光光度计（SFZ0806011349，上海）。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞处理 取SGC-7901/ADR细胞（在接种两周前培养于不含ADM的培养液中）对数生长期，以每孔2 mL接种于6孔板上，然后培养24 h，实验孔分别标记为A（对照组）、B（5-FU组）、C（斑贞1号组）D（斑贞1号 + 5-FU）、E（斑贞1号 + 5-FU+TMP）。每孔分别加入等量新的培养液；5-FU稀释液；斑贞1号稀释液； 5-FU+斑贞1号； 5-FU+TMP +斑贞1号（各组药物浓度根据MTT试验结果，选取各自的IC50值）。然后继续培养48 h，用PBS缓冲液冲洗1次，准备提取总mRNA。
1.3.2 RT- PCR检测 采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，以mRNA为模板经逆转录合成cDNA， GST-π上游引物5’-CAGGAGGGCTCACTC-3’下游引物5’-GATCAGCAGCAAGACCAGCAG -3’，长350 bp。 -action上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，先逆转录出cDNA， 每个样品反应体系25 μL，即dNTP Mixture 2 μL，Takara Taq 1 μL，ddH2O 13.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus） 2.5 μL， 各样品cDNA 5 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，灭菌蒸馏水13.5 μL。预变性94℃ 3 min→变性92℃ 30 s→退火55℃ 30 s→延伸72℃30 s 共30个循环，最后延伸72℃ 10 min。扩增结束后，取样品10 μL，2％琼脂糖，100 V恒压电泳60 min。紫外反射透射分析仪采集电泳图像，凝胶图象分析系统扫描得到各电泳带平均吸光度值。
1.4 统计学方法
应用SPSS17.0统计软件包进行方差分析及LSD-t检验，计量数据以（）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SGC7901/ADR细胞经不同药物处理后GST-π mRNA的表达
5-FU组GST-πmRNA表达量为（2.07±0.25），对照组为（2.19±0.28），二者比较差异无统计学意义（P=0.240）。其他药物组与对照组及组间比较有统计学意义（P＜0.05）。斑贞1号+FU +TMP组表达量最少。见表1。
表1 SGC7901/ADR细胞酸性谷胱甘肽S-转移酶在不同药物组表达（）
组别 GST-π相对吸光度值 P值
A阴性对照组 2.19±0.28
B 5-FU 2.07±0.25 0.240﹡
C班贞1号 1.79±0.27 0.000﹡ 0.000﹡﹡
D班贞1号+5-FU 1.30±0.18 0.000﹡ 0.000﹡﹡﹡
E班贞1号+5-FU+TMP 1.07±0.04 0.000﹡ 0.021﹡﹡﹡﹡
注：﹡为各组与A组比较；﹡﹡为C组与B组比较；﹡﹡﹡为D组与C组比较；﹡﹡﹡﹡为E组与D比较
所有RT- PCR扩增产物均产生β -action基因扩增带，证实逆转录所得cDNA的完整性和PCR反应是成功的。GST-π和β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后分别位于350bp和548bp，和预期长度吻合，说明均为特异性扩增片段。见图1。
3 讨论
在我国胃癌发病率及死亡率居恶性肿瘤第2位[2]，化疗是综合治疗胃癌的重要方法之一，但肿瘤的多药耐药是导致化疗失败的主要原因之一[3]。本课题组先前已证实人胃癌细胞系SGC-7901/ADR细胞对5-FU具有耐药性，相对耐药性为97.49[4]；GST-π是近年来被发现的重要耐药基因，李敏等[5]研究表明，长期使用化疗药时，肿瘤细胞内的GST-π水平会升高，导致耐药性的产生。GST-π引起耐药的机制[6]：（1）GST-π可通过催化谷胱甘肽（GSH）与化学药物结合，从而降低化学
Mark A A1 B B1 C C1 D D1 E E1 Mark
图1 细胞经不同药物处理后酸性谷胱甘肽S-转移酶 mRNA
表达的凝胶图像
药物的细胞毒作用；（2）GST-π本身与亲脂药物结合，增加其水溶性，促进其排泄，使该药物的抗腫瘤作用下降。本研究显示，5-FU组GST-π mRNA表达与对照组比较无统计学意义（P=0.240），说明GST-π参与耐药细胞对5-FU的耐药性。
斑贞1号合剂主药为斑蝥和露蜂房，女贞子和山茱萸为辅佐药，其各成分用量（60 kg）是成人的临床用量。斑蝥素能抑制肿瘤细胞核酸合成，具有解毒杀瘤作用，而且无骨髓抑制作用。女贞子扶正祛邪，对染色体损伤和突变效应具保护作用，且能增强机体免疫力，TMP是一种中药钙离子通道阻滞剂，可通过多种途径对肿瘤起到治疗和逆转多药耐药作用。本课题组先前已证实300 mg/L TMP能显著增加SGC-7901/ADR细胞对5-FU的敏感性[7]；斑贞1号、TMP联合5-FU对SGC-7901/ADR细胞有较强的逆转作用[1]。本研究显示，斑贞1号+5-FU+TMP GST-πmRNA 表达量明显低于其他用药组，均有显著性差异（P＜0.05），说明3种药联合可显著抑制耐药细胞GST-πmRNA的高表达，克服了由GST-π基因介导的多药耐药性，增强了治疗效果。
[参考文献]
[1] 侯培珍，张娟，赵永峰.中西药结合对胃癌细胞多药耐药性逆转和诱导凋亡的实验研究[J].第四军医大学学报，2008，29（13）：1181-1183.
[2] Yang L. Incidence and mortality of gastric cancer in China[J]. World J Gastroenterol， 2006，12（1）：17-20.
[3] 布立民，韩英.逆转胃肠道肿瘤多药耐药的研究进展[J].实用癌症杂志，2002，18（1）：105-107.
[4] 郝旺胜，侯先文，侯培珍.斑贞1号联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的细胞毒作用[J].临床荟萃，2008，23（24）：1762-1764.
[5] 李敏.DNA聚合酶p、GsT基因表达的调控对食管癌细胞耐药性的作用[D].郑州大学，2007：52-54.
[6] 张帆，漆林涛，陈惠祯，等.卵巢癌中P-gP与GST-π的表达对化疗耐药预测的价值[J].中华肿瘤杂志，2001，7（23）：313-316.
[7] 杨叶，侯培珍，张娟.川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的杀伤作用[J].肿瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.
（收稿日期：2012-01-06）
[关键词] 胃癌； 斑贞1号； TMP； 5-FU； GST-π
[中图分类号] R735.2 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2012）04-34-02
Banzhen 1，Tetra methylpyrazine and 5-fluorouracil effect on human gastric cancer cells Glutathione-S-transferase
FU Guizhen1 ZHANG Aimin2
1.Department of Internal Medicine,Huade County Hospital of Inner Mongolia Autonomous Region, Huade 013350, China; 2.Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Baotou 014010, China
[Abstract] Objective To explore of the correlativity between Banzhen 1, Tetra methylpyrazine and 5-fluorouracil reversing human gastric cancer cell line SGC-7901/ADR with Glutathione-s-transferase expressions. Methods Semi-quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction was used for comparison of GST-πmRNA expression for cell line SGC-7901/ADR in group of 5-FU，5-FU and Banzhen 1,TMP. Results The expression of GST-πmRNA between the 5-FU group and the control group，there was no significant differences (P＞ 0.05)， while 5-Fu and Banzhen 1 group and TMP group was decreased significantly(P＜0.05). Conclusion It is possible correlated to GST-π for Banzhen 1，TMP and 5-FU reversed multidrug resistance in human gastric cancer cells，which may supply a new theoretical basis for the clinical effective treatment of gastric carcinoma.
[Key words] Stomach cancer; Banzhen 1;TMP; 5-FU; GST-π
化療是治疗胃癌的有效手段之一，但胃癌多药耐药性（MDR）是导致化疗失败的主要原因。近几年发现GST-π在胃癌多药耐药性方面起着重要作用，本课题先前已证实斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞有较强的逆转作用[1]。因此，笔者在此实验的基础上，通过检测不同药物组GST-πmRNA的表达量从分子生物的角度进一步探讨斑贞1号+TMP+5-FU对人胃癌SGC-7901/ADR细胞的作用机制。
1 材料与方法
1.1 细胞系
耐阿霉素人胃癌细胞株SGC-7901/ADR细胞，西京医院消化研究所提供。
1.2 药物、试剂及主要仪器
斑贞1号由斑蝥、露蜂房、女贞子、山茱萸按一定比例组成，包头医学院第一附属医院制备，每毫升含原生药0.2 g，4℃保存。TMP、5-FU （南通精华制药有限公司），RPMI1640（美国GIBCO公司产品），新生小牛血清（赛默飞世尔生物化学制造）、二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶（美国Sigma公司），RT-PCR试剂盒及Trizol（TakaRa公司），引物（上海生工生物工程有限公司），PCR扩增仪（美国AB公司）、电泳仪（DF-D，北京）、紫外分光光度计（SFZ0806011349，上海）。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞处理 取SGC-7901/ADR细胞（在接种两周前培养于不含ADM的培养液中）对数生长期，以每孔2 mL接种于6孔板上，然后培养24 h，实验孔分别标记为A（对照组）、B（5-FU组）、C（斑贞1号组）D（斑贞1号 + 5-FU）、E（斑贞1号 + 5-FU+TMP）。每孔分别加入等量新的培养液；5-FU稀释液；斑贞1号稀释液； 5-FU+斑贞1号； 5-FU+TMP +斑贞1号（各组药物浓度根据MTT试验结果，选取各自的IC50值）。然后继续培养48 h，用PBS缓冲液冲洗1次，准备提取总mRNA。
1.3.2 RT- PCR检测 采用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，以mRNA为模板经逆转录合成cDNA， GST-π上游引物5’-CAGGAGGGCTCACTC-3’下游引物5’-GATCAGCAGCAAGACCAGCAG -3’，长350 bp。 -action上游引物5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物为5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，先逆转录出cDNA， 每个样品反应体系25 μL，即dNTP Mixture 2 μL，Takara Taq 1 μL，ddH2O 13.5 μL，10×PCR Buffer（Mg2+Plus） 2.5 μL， 各样品cDNA 5 μL，目的基因上、下游引物各0.5 μL，灭菌蒸馏水13.5 μL。预变性94℃ 3 min→变性92℃ 30 s→退火55℃ 30 s→延伸72℃30 s 共30个循环，最后延伸72℃ 10 min。扩增结束后，取样品10 μL，2％琼脂糖，100 V恒压电泳60 min。紫外反射透射分析仪采集电泳图像，凝胶图象分析系统扫描得到各电泳带平均吸光度值。
1.4 统计学方法
应用SPSS17.0统计软件包进行方差分析及LSD-t检验，计量数据以（）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SGC7901/ADR细胞经不同药物处理后GST-π mRNA的表达
5-FU组GST-πmRNA表达量为（2.07±0.25），对照组为（2.19±0.28），二者比较差异无统计学意义（P=0.240）。其他药物组与对照组及组间比较有统计学意义（P＜0.05）。斑贞1号+FU +TMP组表达量最少。见表1。
表1 SGC7901/ADR细胞酸性谷胱甘肽S-转移酶在不同药物组表达（）
组别 GST-π相对吸光度值 P值
A阴性对照组 2.19±0.28
B 5-FU 2.07±0.25 0.240﹡
C班贞1号 1.79±0.27 0.000﹡ 0.000﹡﹡
D班贞1号+5-FU 1.30±0.18 0.000﹡ 0.000﹡﹡﹡
E班贞1号+5-FU+TMP 1.07±0.04 0.000﹡ 0.021﹡﹡﹡﹡
注：﹡为各组与A组比较；﹡﹡为C组与B组比较；﹡﹡﹡为D组与C组比较；﹡﹡﹡﹡为E组与D比较
所有RT- PCR扩增产物均产生β -action基因扩增带，证实逆转录所得cDNA的完整性和PCR反应是成功的。GST-π和β-action的RT-PCR产物经琼脂糖分离后分别位于350bp和548bp，和预期长度吻合，说明均为特异性扩增片段。见图1。
3 讨论
在我国胃癌发病率及死亡率居恶性肿瘤第2位[2]，化疗是综合治疗胃癌的重要方法之一，但肿瘤的多药耐药是导致化疗失败的主要原因之一[3]。本课题组先前已证实人胃癌细胞系SGC-7901/ADR细胞对5-FU具有耐药性，相对耐药性为97.49[4]；GST-π是近年来被发现的重要耐药基因，李敏等[5]研究表明，长期使用化疗药时，肿瘤细胞内的GST-π水平会升高，导致耐药性的产生。GST-π引起耐药的机制[6]：（1）GST-π可通过催化谷胱甘肽（GSH）与化学药物结合，从而降低化学
Mark A A1 B B1 C C1 D D1 E E1 Mark
图1 细胞经不同药物处理后酸性谷胱甘肽S-转移酶 mRNA
表达的凝胶图像
药物的细胞毒作用；（2）GST-π本身与亲脂药物结合，增加其水溶性，促进其排泄，使该药物的抗腫瘤作用下降。本研究显示，5-FU组GST-π mRNA表达与对照组比较无统计学意义（P=0.240），说明GST-π参与耐药细胞对5-FU的耐药性。
斑贞1号合剂主药为斑蝥和露蜂房，女贞子和山茱萸为辅佐药，其各成分用量（60 kg）是成人的临床用量。斑蝥素能抑制肿瘤细胞核酸合成，具有解毒杀瘤作用，而且无骨髓抑制作用。女贞子扶正祛邪，对染色体损伤和突变效应具保护作用，且能增强机体免疫力，TMP是一种中药钙离子通道阻滞剂，可通过多种途径对肿瘤起到治疗和逆转多药耐药作用。本课题组先前已证实300 mg/L TMP能显著增加SGC-7901/ADR细胞对5-FU的敏感性[7]；斑贞1号、TMP联合5-FU对SGC-7901/ADR细胞有较强的逆转作用[1]。本研究显示，斑贞1号+5-FU+TMP GST-πmRNA 表达量明显低于其他用药组，均有显著性差异（P＜0.05），说明3种药联合可显著抑制耐药细胞GST-πmRNA的高表达，克服了由GST-π基因介导的多药耐药性，增强了治疗效果。
[参考文献]
[1] 侯培珍，张娟，赵永峰.中西药结合对胃癌细胞多药耐药性逆转和诱导凋亡的实验研究[J].第四军医大学学报，2008，29（13）：1181-1183.
[2] Yang L. Incidence and mortality of gastric cancer in China[J]. World J Gastroenterol， 2006，12（1）：17-20.
[3] 布立民，韩英.逆转胃肠道肿瘤多药耐药的研究进展[J].实用癌症杂志，2002，18（1）：105-107.
[4] 郝旺胜，侯先文，侯培珍.斑贞1号联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的细胞毒作用[J].临床荟萃，2008，23（24）：1762-1764.
[5] 李敏.DNA聚合酶p、GsT基因表达的调控对食管癌细胞耐药性的作用[D].郑州大学，2007：52-54.
[6] 张帆，漆林涛，陈惠祯，等.卵巢癌中P-gP与GST-π的表达对化疗耐药预测的价值[J].中华肿瘤杂志，2001，7（23）：313-316.
[7] 杨叶，侯培珍，张娟.川芎嗪联合氟尿嘧啶对胃癌细胞SGC-7901/ADR的杀伤作用[J].肿瘤防治研究，2008，35（9）：624-626.
（收稿日期：2012-01-06）