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【摘要】 目的：探究在大鼠神经旁路移植术后应用FK1706对促进神经再生的作用。方法：SD雄性成年大鼠20只，随机分成两组，每组10只，行左坐骨神经开窗离断-自体桡神经旁路移植术。实验组（FK1706组）术后即日开始连续8周左下肢局部肌注FK1706（0.32 mg/kg），对照组做空白对照。8周后行左侧坐骨神经电生理监测、左腓肠肌肌肉湿重及肌纤维横截面积测定。结果：8周后，实验组的CAMP波幅高于对照组，MNCV快于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）。实验组的腓肠肌湿重及肌纤维面积均高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。两组的近端有髓神经纤维数比较，差异无统计学意义（P>0.05），实验组远端有髓神经纤维数、纤维横截面积均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01）。结论：大鼠神经旁路移植术后应用FK1706能够移植神经再生。
【关键词】 FK1706； 自体神经移植； 神经再生
Study on Effect of FK1706 to Accelerate Neuroregeneration after Nerve Bypass Grafting Surgery/XIAO Yuhua，XU Jie，LI Jun.//Medical Innovation of China，2018，15（13）：023-026
【Abstract】 Objective：To investigate the effects of FK1706 to neuroregeneration after nerve bypass grafting.Method：20 adult male SD rats were randomly divided into two groups，10 cases in each group，the left sciatic nerve fenestration and autologous radial nerve bypass grafting was performed.In the experimental group，FK1706（0.32 mg/kg） was injected into the left lower extremities for 8 weeks immediately after the operation，the control group was made blank control.After 8 weeks，the electrophysiological monitoring of the left sciatic nerve，the wet weight of the left gastrocnemius muscle and the cross section of the muscle fiber were measured.Result：After 8 weeks，the amplitude of CAMP in the experimental group was higher than that in the control group，MNCV was faster than that of control group，the differences were statistically significant（P<0.01）.The wet weight and fiber area of gastrocnemius in the experimental group were higher than those in the control group（P<0.05）.There was no significant difference in the number of myelinated nerve fibers between the two groups（P>0.05），the number and cross-sectional area of distal myelinated nerve fibers in the experimental group were significantly better than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：The effects of FK1706 to accelerate neuroregeneration after nerve bypass grafting surgery is siginicant.
【Key words】 FK1706； Autogenous nerve transplantation； Neuroregeneration
First-author’s address：Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.13.006
神经旁路移植术在临床上可用于治疗有神经瘤生成的周围神经损伤，该手术方式既保留了神经原有的功能，还增加了动力神经[1]。实验报道肯定了神经旁路移植术后移植神经再生的现象。临床上周围神经再生速度1～2 mm/d，修复效果欠佳，因此，希望找到一种促进神经再生且副作用小的药物。
已被FDA认证的FK506是一种免疫抑制性药物[2]。FK506在广泛应用于器官移植后免疫抑制的领域中发现其具有促进神经生长的作用[3]，但FK506本身对人体组织器官具有强效免疫抑制作用，这大大局限了FK506在神经损伤后治疗作用。FK1706作为FK506的衍生物在2005年首先被报道[4]，其保留了促神经生长的作用，很大程度上弱化了FK506的免疫抑制作用。有文献报道，FK1706能够促进轴突再生的基因转录和表达[5]。本研究建立大鼠坐骨神经损伤模型，肌注FK1706药物进行干預，以评价其促进神经再生的作用。 1 材料与方法
1.1 试剂与器材 FK1706：南京大学实验室合成；二甲基亚砜（DMSO）：日本sigma-D2650；电子分析天平：Sartorius-BS224S，精度为0.1 mg；透射电子显微镜：PHILIPS EM208；光学显微镜：Olympus，日本；超薄切片机：Leica UC-6型；游标卡尺：上海量具厂；肌电/诱发电位仪：Keypoint，美国Medtronic公司；手术显微镜：SXP-1B型，上海医用光学仪器厂；显微手术器械：SFZ-967，上海手术器械分厂。药液配置：电子分析天平准确称量FK1706粉剂0.056 0 g，充分溶解于56 mL DMSO，移液管移入试剂瓶中，标记为FK1706溶液，存于4 ℃冰箱备用。
1.2 模型制备 腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥钠
（40 mg/kg）]大鼠后，体位取平卧位，有效固定，备皮消毒铺巾，取8 mm左侧桡神经备用。大鼠体位转变为俯卧位，有效固定，在大鼠左大腿做一纵向切口，逐层进入分离组织，见坐骨神经。持针钳于显微镜下钳夹其神经干10 s，镜下确认完全离断神经干，仅有外膜相连。于钳夹点两端3 mm处外膜上分别开一1.5 mm直径的窗口，将自体桡神经与两侧窗口行端侧吻合，确定无活动性出血后逐层缝合。神经旁路移植模型见图1。
1.3 实验动物分组与药物干预 苦味酸标记雄性健康成年SD大鼠20只，200～250 g/只（由福建医科大学动物实验中心提供）。随机分为实验组、对照组，每组10只。大鼠由专人饲养，研究过程中对大鼠的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见的要求》[6]。实验组大鼠左侧大腿肌注0.32 mg/kg的FK1706试剂，连续8周（含术日），1次/d。对照组空白，正常喂养。
1.4 观察指标 （1）坐骨神经电生理监测：8周后对大鼠左下肢进行电生理监测。行腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥钠（40 mg/kg）]后，取平卧位，固定后术区消毒铺巾，逐层进入，暴露坐骨神经，分离腓肠肌。记录电极插入腓肠肌肌腹，接地电极连接大鼠尾部。于坐骨神经端侧吻合口近端坐骨结节水平（P点）和远端神经分支处（D点）放置平行电极（两极间距固定为2 mm），进行重频电刺激（电流10 mA），记录复合运动动作电位（CMAP）及其波幅，测量电极间距，计算运动神经传导速度（MNCV）。MNCV=两次电极间距/动作电位潜伏期差值。电生理监测过程中用生理盐水保持肌肉湿润，在室温28 ℃下进行。（2）腓肠肌湿重及肌纤维面积：完整分离大鼠左侧腓肠肌，修洁去除表面结构，立即置于电子分析天平上，测量肌肉湿重。称重后的腓肠肌用10%的福尔马林固定，脱水、石蜡包埋，在标本的最大横径作5 ?m厚的切片，HE染色后制片。在40倍目镜、0.70 ?m/象数下测定肌纤维横截面积。（3）有髓神经纤维数及截面积：分别于坐骨神经两端吻合口3 mm处取材（2～3 mm）。以10%的福尔马林固定，制片0.5 ?m后HE染色。在400倍光镜下，统计有髓神经纤维数量。在40倍目镜TJTY-300图像分析仪、定标值为0.38 ?m/象数的条件下测量神经纤维横截面积。作1条过视野中心的直线，测定该直线上神经纤维的横截面积。
1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0分析数据，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况 麻醉意外死亡2只，及时进行了补充。实验期间各组大鼠一般情况可。
2.2 两组坐骨神经电生理监测结果对比 8周后，实验组的CAMP波幅高于对照组，MNCV快于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.3 两组腓肠肌湿重及肌纤维横截面积对比 8周后，实验组肌肉湿重（753.54±105.91）mg，重于对照组（598.02±65.02）mg，差异有统计学意义（t=3.957，P<0.05）。实验组腓肠肌肌纤维横截面积（246.55±50.41）μm2，大于对照组的（178.90±33.59）μm2，差异有统计学意义（t=3.532，P<0.05）。
2.4 两组有髓神经纤维数与横截面积比较 两组的近端有髓神经纤维数比较，差异无统计学意义（P>0.05）；试验组远端有髓神经纤维数、神经纤维横截面积明显大于对照组（P<0.01），见表2。
3 讨论
周围神经完全或不完全损伤后，诸多因素影响其功能恢复，例如年龄、损伤类型、程度、平面、修复时机、手段及康复训练等[7-8]。影响因素中最重要的是神经损伤到行神经修复的时间。由于神经损伤，肌肉失去神经支配，去神经化超过一定的时间后，运动终板功能将不可逆破坏及导致不同程度的肌肉萎缩[8]。Sunderland等[9]报道肌肉去神经化时间长短与神经肌肉功能恢复程度相关。目前临床上治疗周围神经损伤普遍采用神经修复、神经移植和应用促神经生长药物等[10-11]。但由于神经再生速度缓慢[8，12]，如何加快神经再生速度及修复其结构成为临床研究的热点。
目前治疗周围神经损伤常用的方法是自体神经端端吻合和端侧吻合移植[13]。文献[14-16]分别在治疗面瘫和实验研究中验证了神经端侧吻合具有一定应用前景。本实验采用的移植方法略不同于普通的端侧吻合，动力神经取自游离的自体桡神经，损伤神经与动力神经两端进行端侧吻合。旁路神经移植术后应用FK1706试剂，明显改善了损伤的神经的结构和再生修复。
FK1706是FK506的衍生物，FK506可以表现出长期的加速神经生长、再生的作用[17]，但具有强效免疫抑制作用。Price等[18]通过实验改变FK506的效应区，合成了FK1706，保留了FK506促进神经再生作用的同时，极大的减弱了免疫抑制作用，使之具有良好的应用前景。文献[19]报道，FK1706促进神经生长可能是通过与FKBP-52结合并激活MAPK信号传导通路，刺激神经生长因子（NGF）介导的轴突生长来实现的。FK1706不仅呈现剂量依赖性的促进神经再生作用，还具有良好的治疗窗。Yamaji等[19]通过实验发现对于脊髓受损的大鼠，延迟1周后进行FK1706干预，仍然能够促进神经再生。FK1706的治療时间窗迎合了临床治疗的需要。 本实验观察到8周后实验组CMAP的波幅、MNCV传导速度、腓肠肌湿重截面积、远端有髓神经纤维数均优于对照组（P<0.05），这表明实验组对改善神经损伤程度明显优于对照组。
在实验对象的选择上，本研究考虑到性激素对神经再生会产生影响，故全部采用了成年健康雄性SD大鼠，消除实验干扰。Koeing对黄体酮和雌雄性大鼠的建模支持这观点[20-22]。
在实验模型的选择上，大鼠坐骨神经干较粗且走形于大腿中上1/3部分没有分支，并且可容易进行显微操作，因此周围神经损伤和修复的研究常选用此模型[23]。
在评价神经损伤后恢复和再生的指标选择上，电生理和组织学检查最为常用。电生理监测包含波幅和传导速度等项目。电生理检查能用于判断神经再生，评价其手术后疗效及功能恢复情况。波幅体现出了神经纤维的数目和同步兴奋的程度。神经纤维较成熟且同步兴奋度较高，波形规则且波幅較大。神经传导速度反映了冲动的传导能力，当受损神经开始修复时，随着轴突、髓鞘的形成，神经传导速度加快[24]。通过实验发现，实验组CMAP的波幅更大，MNCV更快，提示FK1706能够促进神经再生。
对神经肌肉进行组织学检查可以直接观察其的形态学特征。对肌肉进行HE染色制片，可以观察基本结构、肌纤维及肌肉的萎缩程度，以此判断去神经化情况。透射电镜下测量髓鞘的各项参数，由此可反映出神经再生的情况。实验组神经纤维数、神经纤维横截面积均大于对照组（P<0.05）。因此，笔者推论：FK1706较对照组对神经再生有着改善作用。
本实验研究证实了，FK1706对神经旁路移植术后大鼠神经CMAP、MNCV、腓肠肌湿重和截面积、有髓神经纤维数、再生髓鞘厚度、再生轴突直径比具有改善作用，FK1706具有促进神经旁路移植术后再生神经的作用[25-26]。
感谢福建省立医院骨二科在撰写论文方面的帮助，感谢福建省立医院科研科全体老师的关怀，感谢福建医科大学动物实验中心在实验方面给予的大力支持。
参考文献
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（收稿日期：2018-01-24） （本文编辑：张爽）
【关键词】 FK1706； 自体神经移植； 神经再生
Study on Effect of FK1706 to Accelerate Neuroregeneration after Nerve Bypass Grafting Surgery/XIAO Yuhua，XU Jie，LI Jun.//Medical Innovation of China，2018，15（13）：023-026
【Abstract】 Objective：To investigate the effects of FK1706 to neuroregeneration after nerve bypass grafting.Method：20 adult male SD rats were randomly divided into two groups，10 cases in each group，the left sciatic nerve fenestration and autologous radial nerve bypass grafting was performed.In the experimental group，FK1706（0.32 mg/kg） was injected into the left lower extremities for 8 weeks immediately after the operation，the control group was made blank control.After 8 weeks，the electrophysiological monitoring of the left sciatic nerve，the wet weight of the left gastrocnemius muscle and the cross section of the muscle fiber were measured.Result：After 8 weeks，the amplitude of CAMP in the experimental group was higher than that in the control group，MNCV was faster than that of control group，the differences were statistically significant（P<0.01）.The wet weight and fiber area of gastrocnemius in the experimental group were higher than those in the control group（P<0.05）.There was no significant difference in the number of myelinated nerve fibers between the two groups（P>0.05），the number and cross-sectional area of distal myelinated nerve fibers in the experimental group were significantly better than those in the control group，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：The effects of FK1706 to accelerate neuroregeneration after nerve bypass grafting surgery is siginicant.
【Key words】 FK1706； Autogenous nerve transplantation； Neuroregeneration
First-author’s address：Fujian Provincial Hospital，Fuzhou 350001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.13.006
神经旁路移植术在临床上可用于治疗有神经瘤生成的周围神经损伤，该手术方式既保留了神经原有的功能，还增加了动力神经[1]。实验报道肯定了神经旁路移植术后移植神经再生的现象。临床上周围神经再生速度1～2 mm/d，修复效果欠佳，因此，希望找到一种促进神经再生且副作用小的药物。
已被FDA认证的FK506是一种免疫抑制性药物[2]。FK506在广泛应用于器官移植后免疫抑制的领域中发现其具有促进神经生长的作用[3]，但FK506本身对人体组织器官具有强效免疫抑制作用，这大大局限了FK506在神经损伤后治疗作用。FK1706作为FK506的衍生物在2005年首先被报道[4]，其保留了促神经生长的作用，很大程度上弱化了FK506的免疫抑制作用。有文献报道，FK1706能够促进轴突再生的基因转录和表达[5]。本研究建立大鼠坐骨神经损伤模型，肌注FK1706药物进行干預，以评价其促进神经再生的作用。 1 材料与方法
1.1 试剂与器材 FK1706：南京大学实验室合成；二甲基亚砜（DMSO）：日本sigma-D2650；电子分析天平：Sartorius-BS224S，精度为0.1 mg；透射电子显微镜：PHILIPS EM208；光学显微镜：Olympus，日本；超薄切片机：Leica UC-6型；游标卡尺：上海量具厂；肌电/诱发电位仪：Keypoint，美国Medtronic公司；手术显微镜：SXP-1B型，上海医用光学仪器厂；显微手术器械：SFZ-967，上海手术器械分厂。药液配置：电子分析天平准确称量FK1706粉剂0.056 0 g，充分溶解于56 mL DMSO，移液管移入试剂瓶中，标记为FK1706溶液，存于4 ℃冰箱备用。
1.2 模型制备 腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥钠
（40 mg/kg）]大鼠后，体位取平卧位，有效固定，备皮消毒铺巾，取8 mm左侧桡神经备用。大鼠体位转变为俯卧位，有效固定，在大鼠左大腿做一纵向切口，逐层进入分离组织，见坐骨神经。持针钳于显微镜下钳夹其神经干10 s，镜下确认完全离断神经干，仅有外膜相连。于钳夹点两端3 mm处外膜上分别开一1.5 mm直径的窗口，将自体桡神经与两侧窗口行端侧吻合，确定无活动性出血后逐层缝合。神经旁路移植模型见图1。
1.3 实验动物分组与药物干预 苦味酸标记雄性健康成年SD大鼠20只，200～250 g/只（由福建医科大学动物实验中心提供）。随机分为实验组、对照组，每组10只。大鼠由专人饲养，研究过程中对大鼠的处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见的要求》[6]。实验组大鼠左侧大腿肌注0.32 mg/kg的FK1706试剂，连续8周（含术日），1次/d。对照组空白，正常喂养。
1.4 观察指标 （1）坐骨神经电生理监测：8周后对大鼠左下肢进行电生理监测。行腹腔麻醉[2.5%苯巴比妥钠（40 mg/kg）]后，取平卧位，固定后术区消毒铺巾，逐层进入，暴露坐骨神经，分离腓肠肌。记录电极插入腓肠肌肌腹，接地电极连接大鼠尾部。于坐骨神经端侧吻合口近端坐骨结节水平（P点）和远端神经分支处（D点）放置平行电极（两极间距固定为2 mm），进行重频电刺激（电流10 mA），记录复合运动动作电位（CMAP）及其波幅，测量电极间距，计算运动神经传导速度（MNCV）。MNCV=两次电极间距/动作电位潜伏期差值。电生理监测过程中用生理盐水保持肌肉湿润，在室温28 ℃下进行。（2）腓肠肌湿重及肌纤维面积：完整分离大鼠左侧腓肠肌，修洁去除表面结构，立即置于电子分析天平上，测量肌肉湿重。称重后的腓肠肌用10%的福尔马林固定，脱水、石蜡包埋，在标本的最大横径作5 ?m厚的切片，HE染色后制片。在40倍目镜、0.70 ?m/象数下测定肌纤维横截面积。（3）有髓神经纤维数及截面积：分别于坐骨神经两端吻合口3 mm处取材（2～3 mm）。以10%的福尔马林固定，制片0.5 ?m后HE染色。在400倍光镜下，统计有髓神经纤维数量。在40倍目镜TJTY-300图像分析仪、定标值为0.38 ?m/象数的条件下测量神经纤维横截面积。作1条过视野中心的直线，测定该直线上神经纤维的横截面积。
1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0分析数据，计量资料用（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况 麻醉意外死亡2只，及时进行了补充。实验期间各组大鼠一般情况可。
2.2 两组坐骨神经电生理监测结果对比 8周后，实验组的CAMP波幅高于对照组，MNCV快于对照组，差异均有统计学意义（P<0.01），见表1。
2.3 两组腓肠肌湿重及肌纤维横截面积对比 8周后，实验组肌肉湿重（753.54±105.91）mg，重于对照组（598.02±65.02）mg，差异有统计学意义（t=3.957，P<0.05）。实验组腓肠肌肌纤维横截面积（246.55±50.41）μm2，大于对照组的（178.90±33.59）μm2，差异有统计学意义（t=3.532，P<0.05）。
2.4 两组有髓神经纤维数与横截面积比较 两组的近端有髓神经纤维数比较，差异无统计学意义（P>0.05）；试验组远端有髓神经纤维数、神经纤维横截面积明显大于对照组（P<0.01），见表2。
3 讨论
周围神经完全或不完全损伤后，诸多因素影响其功能恢复，例如年龄、损伤类型、程度、平面、修复时机、手段及康复训练等[7-8]。影响因素中最重要的是神经损伤到行神经修复的时间。由于神经损伤，肌肉失去神经支配，去神经化超过一定的时间后，运动终板功能将不可逆破坏及导致不同程度的肌肉萎缩[8]。Sunderland等[9]报道肌肉去神经化时间长短与神经肌肉功能恢复程度相关。目前临床上治疗周围神经损伤普遍采用神经修复、神经移植和应用促神经生长药物等[10-11]。但由于神经再生速度缓慢[8，12]，如何加快神经再生速度及修复其结构成为临床研究的热点。
目前治疗周围神经损伤常用的方法是自体神经端端吻合和端侧吻合移植[13]。文献[14-16]分别在治疗面瘫和实验研究中验证了神经端侧吻合具有一定应用前景。本实验采用的移植方法略不同于普通的端侧吻合，动力神经取自游离的自体桡神经，损伤神经与动力神经两端进行端侧吻合。旁路神经移植术后应用FK1706试剂，明显改善了损伤的神经的结构和再生修复。
FK1706是FK506的衍生物，FK506可以表现出长期的加速神经生长、再生的作用[17]，但具有强效免疫抑制作用。Price等[18]通过实验改变FK506的效应区，合成了FK1706，保留了FK506促进神经再生作用的同时，极大的减弱了免疫抑制作用，使之具有良好的应用前景。文献[19]报道，FK1706促进神经生长可能是通过与FKBP-52结合并激活MAPK信号传导通路，刺激神经生长因子（NGF）介导的轴突生长来实现的。FK1706不仅呈现剂量依赖性的促进神经再生作用，还具有良好的治疗窗。Yamaji等[19]通过实验发现对于脊髓受损的大鼠，延迟1周后进行FK1706干预，仍然能够促进神经再生。FK1706的治療时间窗迎合了临床治疗的需要。 本实验观察到8周后实验组CMAP的波幅、MNCV传导速度、腓肠肌湿重截面积、远端有髓神经纤维数均优于对照组（P<0.05），这表明实验组对改善神经损伤程度明显优于对照组。
在实验对象的选择上，本研究考虑到性激素对神经再生会产生影响，故全部采用了成年健康雄性SD大鼠，消除实验干扰。Koeing对黄体酮和雌雄性大鼠的建模支持这观点[20-22]。
在实验模型的选择上，大鼠坐骨神经干较粗且走形于大腿中上1/3部分没有分支，并且可容易进行显微操作，因此周围神经损伤和修复的研究常选用此模型[23]。
在评价神经损伤后恢复和再生的指标选择上，电生理和组织学检查最为常用。电生理监测包含波幅和传导速度等项目。电生理检查能用于判断神经再生，评价其手术后疗效及功能恢复情况。波幅体现出了神经纤维的数目和同步兴奋的程度。神经纤维较成熟且同步兴奋度较高，波形规则且波幅較大。神经传导速度反映了冲动的传导能力，当受损神经开始修复时，随着轴突、髓鞘的形成，神经传导速度加快[24]。通过实验发现，实验组CMAP的波幅更大，MNCV更快，提示FK1706能够促进神经再生。
对神经肌肉进行组织学检查可以直接观察其的形态学特征。对肌肉进行HE染色制片，可以观察基本结构、肌纤维及肌肉的萎缩程度，以此判断去神经化情况。透射电镜下测量髓鞘的各项参数，由此可反映出神经再生的情况。实验组神经纤维数、神经纤维横截面积均大于对照组（P<0.05）。因此，笔者推论：FK1706较对照组对神经再生有着改善作用。
本实验研究证实了，FK1706对神经旁路移植术后大鼠神经CMAP、MNCV、腓肠肌湿重和截面积、有髓神经纤维数、再生髓鞘厚度、再生轴突直径比具有改善作用，FK1706具有促进神经旁路移植术后再生神经的作用[25-26]。
感谢福建省立医院骨二科在撰写论文方面的帮助，感谢福建省立医院科研科全体老师的关怀，感谢福建医科大学动物实验中心在实验方面给予的大力支持。
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（收稿日期：2018-01-24） （本文编辑：张爽）