论文部分内容阅读
摘要 采用实时荧光定量RTPCR技术，测定了小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织ABCG2 mRNA相对表达量的差异，并进一步检测了茚虫威的LC50剂量对小菜蛾3龄幼虫ABCG2 mRNA表达量的影响。结果表明，不同发育阶段小菜蛾ABCG2 mRNA相对表达量在雄性成虫中最高，明显高于其他几个发育阶段，分别是3龄的5.63倍、4龄的3.67倍、蛹期的7.36倍、雌虫的3.51倍。4龄幼虫的ABCG2 mRNA在中肠中的表达量最高，分别是马氏管、精巢、残余体的3.12倍、8.96倍、7.33倍，在头和表皮的表达量最低；使用茚虫威的LC50浓度处理小菜蛾3龄幼虫后，ABCG2 mRNA的表达量逐步上升。研究结果为进一步探究茚虫威在小菜蛾体内的代谢与ABCG2之间的关系提供一定的参考。
关键词 小菜蛾； 茚虫威； ABCG2 mRNA； 荧光定量PCR
中图分类号： S 433.4
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2015.06.021
Abstract qRTPCR was used to determine the expression of ABCG2 mRNA at different developmental stages of Plutella xylostella （L.） and in different tissues of its 4thinstar larvae. And influence of LC50 of indoxacarb on expression of ABCG2 mRNA in the 3rdinstar larvae was also investigated. The results showed that the expression of ABCG2 mRNA in male adults of P. xylostella was significantly higher than those in other stages， which was 5.63， 3.67， 7.36 and 3.51 times of that in the 3rd， 4thinstar larvae， the pupal stage， and the female adults， respectively. In different tissues of the 4thinstar larvae， the midgut had the highest expression， which was 3.12， 8.96 and 7.33 times of that in the Malpighian tubule， testis and carcass， respectively. The expression of ABCG2 mRNA in the head and integument were the lowest. To further identify the effect of indoxacarb on ABCG2 mRNA， the relative expression of ABCG2 mRNA in 3rdinstar larvae treated by indoxacarb was also analyzed. The results suggested that the expression of ABCG2 increased gradually over time. The results are helpful for further study of the relationship of ABCG2 expression and indoxacarb resistance in P. xylostella.
Key words Plutella xylostella； indoxacarb； ABCG2 mRNA； qRTPCR
小菜蛾[Plutella xylostella（L.）]属鳞翅目（Lepidoptera），菜蛾科（Plutellidae），一年发生多代，其繁殖率高，世代重叠现象严重，是鳞翅目昆虫中分布最广泛的害虫[1]。尽管人们做了大量工作制定和完善小菜蛾的综合防治策略[23]，但由于小菜蛾本身繁殖很快，加上全球范围内大量使用农药，加快了对其抗药性的选择[4]，导致小菜蛾对多种类型的农药产生了抗性并且抗药性越来越强，成为严重危害十字花科蔬菜作物的一种世界性害虫。茚虫威（indoxacarb）是由美国杜邦公司开发的二嗪类杀虫剂，由于其作用机制独特，对鳞翅目害虫具有卓越的杀虫活性，且对非靶标生物安全，成为替代有机磷类和拟除虫菊酯类杀虫剂防治鳞翅目害虫的理想品种[57]。ABC转运蛋白全称为ATP结合盒膜转运蛋白（ATPbinding cassette transporters），是一大类跨膜转运蛋白，共分7个亚家族（ABCA～ABCG），它们能够利用水解ATP产生的能量介导多种生物分子在细胞内外的运输[8]，降低细胞内生物分子的浓度，目前在医学领域研究比较多。多项报道称ABC基因家族的B、C、G亚族有介导药物转运的能力[912]，例如，P糖蛋白（基因符号ABCB1）、MRP1（基因符号ABCC1）、MRP2（基因符号ABCC2）和BCRP（基因符号ABCG2）跟药物抗药性有关，它们能够将有毒的外源物代谢并运送到细胞外[13]。鉴于ABC转运蛋白的重要性，研究者对一些昆虫，如果蝇、家蚕、粉纹夜蛾等体内的部分ABC转运蛋白进行了研究。
Labbé等从粉纹夜蛾和家蚕中分别获得B、C、G亚族的8、6、13条基因，分析了鳞翅目昆虫对杀虫剂等外源化合物的抗性，指出ABC转运蛋白可能起到显著的作用[14]。近年来，有报道称ABCC2与ABCB1分别与小菜蛾对Bt和阿维菌素的抗性相关[1516]。目前，已报道的昆虫ABCG2还很有限。ABCG2是一种半转运体，包括一个跨膜区域（transmembrane domain， TMD）和一个核酸结合区域（nucleotidebinding domain， NBD），是全转运体ABCB1、ABCC1、ABCC2结构域的一半，尽管与ABCB1、ABCC1和ABCC2在结构域上存在差异，但是在对药物的抗性中是同时发生作用的[14]。本试验比较了小菜蛾不同发育阶段ABCG2 mRNA相对表达量的差异，分析了4龄幼虫不同组织中的ABCG2 mRNA相对表达量的差异，以及茚虫威处理对ABCG2 mRNA相对表达量的影响，以期为以后研究茚虫威在小菜蛾体内代谢与ABCG2的关系提供参考。 1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试昆虫
小菜蛾敏感种群由湖南省农业科学院植物保护研究所提供，在温度为（28±1）℃，相对湿度60%～70%，光周期L∥D=16 h∥8 h的人工气候箱中用人工饲料喂养11代。成虫则以15%的蜂蜜水进行饲喂。
1.1.2 主要试剂和仪器
ABI 7300 Real Time PCR仪（美国ABI公司）；GZ800GSI人工气候箱，韶关市广智科技设备有限公司；茚虫威原药（indoxacarb，95%）上海悦联化工有限公司提供；RNA提取试剂TRIzol由美国 Invitrogen 公司生产；TransScriptTM AllinOne FirstStrand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（AT321），购自北京全式金生物技术有限公司；SuperReal PreMix Plus （SYBR Green） 购自天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯产品。
1.2 试验方法
1.2.1 不同发育期小菜蛾材料的准备
选取小菜蛾1～4龄幼虫以及蛹、雌性成虫、雄性成虫各3头，用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中备用，每个发育期4个生物学重复。
1.2.2 小菜蛾4龄幼虫不同组织部位材料的准备
在PBS缓冲液中解剖20头健康的4龄小菜蛾幼虫，获得小菜蛾的头、表皮、中肠、马氏管、精巢和其他残余物，将各组织在PBS缓冲液中清洗3次，然后用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中备用，每5头幼虫一组，每种组织包括4个生物学重复的样本。
1.2.3 茚虫威处理小菜蛾
为了检测在茚虫威刺激下，小菜蛾ABCG2在转录水平上的反应，将直径为6 cm的甘蓝叶片在0.43 mg/L茚虫威（该浓度为对敏感种群3日龄3龄幼虫的LC50）溶液中浸渍10 s，对照为不经药物处理的叶片，晾干后放置在底部铺有润湿滤纸的培养皿中，接入饥饿2 h的小菜蛾3龄幼虫，每皿20头活虫，放入人工气候培养箱中，在温度（28±1）℃，相对湿度60%～70%，光周期L∥D=16 h∥8 h下，分别喂养24、48、72 h，每个处理4个生物学重复，挑出存活的幼虫用液氮迅速冷却，放入-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2.4 小菜蛾总RNA提取与cDNA第一链的合成
按照TRIzol（Invitrogen）试剂说明中的步骤分别提取不同龄期以及经茚虫威处理的小菜蛾总RNA和不同组织的RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，利用核酸检测仪检测RNA的纯度，合格后使用TransScriptTM AllinOne FirstStrand cDNA Synthesis SuperMix for PCR将RNA反转录合成cDNA第一链，产物于-20 ℃下保存备用。
1.2.5 引物的设计与合成以及内参基因的选择
根据小菜蛾基因组中的ABCG2基因序列设计特异性引物G2YGF和G2YGR（表1），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。将反转录获得的小菜蛾cDNA按10 倍梯度稀释（1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000）后作为模板，通过实时荧光PCR对引物的扩增效率进行检测，引物的扩增效率为96%符合定量试验要求。近几年研究表明，在实时荧光定量试验中，不同处理条件下的内参基因的表达存在一定的差异，所以，针对处理条件的不同，应选用相应条件下表达更稳定的内参基因[17]。因此本文在研究不同发育期、不同组织以及在茚虫威LC50浓度处理条件下ABCG2 mRNA表达量试验中，选用内参基因为延伸因子（elongation factor 1，EF1）、核糖体蛋白 L32（ribosomal protein L32， RPL32）和核糖体蛋白 S23（ribosomal protein S23，RPS23），详细信息见表1。
1.2.6 实时荧光定量PCR
按照SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）试剂盒说明进行加样，然后将样品置于ABI 7300 Real Time PCR仪进行扩增反应。扩增程序设置：95 ℃15 min； 95 ℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃31 s，40个循环。每个样品设置4个独立的生物学重复，每个生物学重复设置4个技术重复。
1.3 试验数据的统计与分析
采用2-ΔΔCt法进行定量分析，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct 内参基因）处理-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照，通过SPSS软件进行差异显著性分析，LSD法进行多重比对，图表用Sigmaplot 12.0软件制作。
2 结果与分析
2.1 ABCG2 mRNA在不同发育阶段的相对表达量
根据图1所示可以看出，小菜蛾ABCG2 mRNA在不同发育阶段的相对表达量存在一定的差异。其中在雄性成虫中表达量最高，分别是3龄幼虫的5.63 倍、4龄的3.67 倍、蛹期7.36 倍、雌虫的3.51 倍。幼虫期ABCG2 mRNA的表达量随龄期增加无显著差异。
2.2 ABCG2 mRNA在4龄幼虫不同组织中的相对表达量
从图2可看出，小菜蛾4龄幼虫ABCG2 mRNA在中肠、马氏管、精巢、残余体相对表达量各不相同。其中在中肠中的相对表达量最高，分别是马氏管、精巢、残余体的3.12、8.96、7.33 倍，ABCG2 mRNA在头和表皮的表达量很低。
2.3 茚虫威处理对ABCG2 mRNA相对表达量的影响
如图3所示，在茚虫威的刺激下，小菜蛾3龄幼虫ABCG2 mRNA在转录水平呈现出相应的反应，表现为随处理时间增加表达量上升，而且在处理1、2、3 d时，表达量分别为同龄期无任何药剂处理组（处理方法同1.2.3）的2.16、4.32、6.76 倍。 3 讨论
越来越多的研究者意识到在实时荧光定量分析中使用1个内参基因容易产生系统误差，所以为了减少计算结果的系统误差，应选用2～3个内参基因，因此本试验选用了在生物因子和非生物因子条件下都表现出良好稳定性的3个内参基因EF1、RPL32和RPS23。ABCG2在小菜蛾不同发育阶段的表达模式与烟芽夜蛾体内ABC蛋白基因相似[18]，有报道称鳞翅目家蚕体内几种起代谢解毒作用的基因存在性别上的差异，这些基因在雌雄个体间表达量的差异导致代谢解毒能力在性别间存在差异[19]。本试验发现ABCG2 mRNA在小菜蛾雌雄个体间的表达量也存在差异，由于目前ABC类转运蛋白在鳞翅目昆虫中研究较少，所以该基因在雌雄个体间差异表达的原因有待进一步研究。小菜蛾ABCG2 mRNA在4龄幼虫的不同组织均有表达，其中在中肠的相对表达量最高，其次是马氏管，这与在家蚕中的研究结果一致[20]。而且，粉纹夜蛾幼虫的中肠、马氏管中与ABCG2基因功能相近的ABCB1基因的表达量很高[21]。这可能是由于中肠是昆虫十分重要的消化和吸收器官，马氏管是重要的排泄器官，这两个器官都跟外源物质的吸收和代谢有关，所以这两个部位ABCG2的高表达表明ABCG2可能在外源物质茚虫威的转运、吸收、代谢中起到一定的作用。生物体通过复杂的解毒系统来保护机体免受外源有毒物质的侵害。在代谢抗性中，有多种酶参与将有毒物质降解为低毒产物并促进产物排出机体外[22]。ABC跨膜转运蛋白可以自主结合有毒物质并将其转运出细胞。Tapadia等研究发现黑腹果蝇经过秋水仙素处理后，P糖蛋白（ABCB1）基因被诱导呈现高表达[21]。有报道称黑腹果蝇在高剂量的MRP的底物甲氨蝶呤毒素作用下，MRP1（基因符号ABCC1）直系同源物dMRP1被诱导高表达[23]。本试验也发现在茚虫威的刺激下，小菜蛾的ABCG2在转录水平呈现为表达量上升，而且，随着处理时间的增加，表达量不断升高，表明ABCG2对茚虫威刺激存在应激反应。这可能是因为小菜蛾的ABCG2参与了茚虫威在小菜蛾体内的转运，被茚虫威诱导所致，使其解毒代谢功能发挥了相应的作用。
本研究结果可为研究茚虫威在小菜蛾体内的代谢与ABCG2之间的关系提供参考，下一步可通过RNAi技术开展基因功能验证的工作，进一步研究ABCG2与昆虫抗药性之间的关系。
参考文献
[1]Talekar N S， Shelton A M.Biology， ecology， and management of the diamondback moth [J]. Annual Review of Entomology， 1993， 38：275301.
[2]Furlong M J， Wright D J， Dosdall L M.Diamondback moth ecology and management： problems， progress， and prospects[J]. Annual Review of Entomology， 2013， 58： 517541.
[3]Grzywacz D， Rossbach A， Rauf A， et al. Current control methods for diamondback moth and other brassica insect pests and the prospects for improved management with lepidopteranresistant Bt vegetable brassicas in Asia and Africa[J]. Crop Protection， 2010， 29（1）： 6879.
[4]Li Zhenyu， Zalucki M P， Bao Huali， et al. Population dynamics and “outbreaks” of diamondback moth （Lepidoptera： Plutellidae） in guangdong province， China： climate or failure of management [J]. Journal of Economic Entomology， 2012， 105（3）： 739752.
[5]Wing K D， Schnee M E， Sacher M， et al. A novel oxadiazine insecticide is bioactivated in lepidopteran larvae [J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 1998， 37（1）： 91103.
[6]Brévault T， Oumarou Y， Achaleke J， et al. Initial activity and persistence of insecticides for the control of bollworms （Lepidoptera： Noctuidae） in cotton crops[J]. Crop Protection， 2009， 28（5）： 401406.
[7]王建军，董红刚. 新型高效杀虫剂茚虫威毒理学研究进展[J]. 植物保护学报， 2009， 35（3）： 2022.
[8]Saurin W， Hofnung M， Dassa E. Getting in or out： early segregation between importers and exporters in the evolution of ATPbinding cassette （ABC） transporters [J]. Journal of Molecular Evolution， 1999， 48（1）： 2241. [9]Dean M， Hamon Y， Chimini G.The human ATPbinding cassette （ABC） transporter superfamily [J]. Journal of Lipid Research， 2001， 42（7）： 10071017.
[10]Dermauw W， Osborne E J， Clark R M， et al. A burst of ABC genes in the genome of the polyphagous spider mite Tetranychus urticae [J]. BMC Genomics， 2013， 14： 317.
[11]Sturm A， Cunningham P， Dean M.The ABC transporter gene family of Daphnia pulex [J].BMC Genomics，2009，10：170188.
[12]Sheps J A， Ralph S， Zhao Z， et al. The ABC transporter gene family of Caenorhabditis elegans has implications for the evolutionary dynamics of multidrug resistance in eukaryotes [J]. Genome Biology， 2004， 5（3）： R15.1R15.17.
[13]Leslie E M， Deeley R G， Cole S P C.Multidrug resistance proteins： role of Pglycoprotein， MRP1， MRP2， and BCRP （ABCG2） in tissue defense [J]. Toxicology and Applied Pharmacology， 2005， 204（3）： 216237.
[14]Labbe R， Caveney S， Donly C.Genetic analysis of the xenobiotic resistanceassociated ABC gene subfamilies of the Lepidoptera [J]. Insect Molecular Biology， 2011，20（2）： 243256.
[15]Baxter S W， BadenesPérez F R， Morrison A， et al. Parallel evolution of Bacillus thuringiensis toxin resistance in Lepidoptera [J]. Genetics， 2011， 189（2）： 675679.
[16]Luo Liang， Sun Yingjian， Wu Yijun.Abamectin resistance in Drosophila is related to increased expression of Pglycoprotein via the dEGFR and dAkt pathways [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2013， 43（8）： 627634.
[17]Fu Wei， Xie Wen， Zhang Zhuo， et al. Exploring valid reference genes for quantitative realtime PCR analysis in Plutella xylostella （Lepidoptera： Plutellidae） [J]. International Journal of Biological Sciences， 2013， 9（8）： 792802.
[18]Lanning C L， Fine R L， Corcoran J J， et al. Tobacco budworm Pglycoprotein： biochemical characterization and its involvement in pesticide resistance [J]. Biochimica et Biophysica ActaGeneral Subjects， 1996， 1291（2）： 155162.
[19]刘海涛， 李兵， 赵国栋， 等. 家蚕幼虫不同龄期体内主要解毒酶及其基因表达的性别差异[J]. 昆虫学报， 2010， 53（5）： 479486.
[20]戚伟平， 马小丽， 何玮毅， 等. 节肢动物ABC转运蛋白及其介导的杀虫剂抗性[J]. 昆虫学报， 2014， 57（6）： 729736.
[21]Tapadia M G， Lakhotia S C.Expression of mdr49 and mdr65 multidrug resistance genes in larval tissues of Drosophila melanogaster under normal and stress conditions [J]. Cell Stress
关键词 小菜蛾； 茚虫威； ABCG2 mRNA； 荧光定量PCR
中图分类号： S 433.4
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2015.06.021
Abstract qRTPCR was used to determine the expression of ABCG2 mRNA at different developmental stages of Plutella xylostella （L.） and in different tissues of its 4thinstar larvae. And influence of LC50 of indoxacarb on expression of ABCG2 mRNA in the 3rdinstar larvae was also investigated. The results showed that the expression of ABCG2 mRNA in male adults of P. xylostella was significantly higher than those in other stages， which was 5.63， 3.67， 7.36 and 3.51 times of that in the 3rd， 4thinstar larvae， the pupal stage， and the female adults， respectively. In different tissues of the 4thinstar larvae， the midgut had the highest expression， which was 3.12， 8.96 and 7.33 times of that in the Malpighian tubule， testis and carcass， respectively. The expression of ABCG2 mRNA in the head and integument were the lowest. To further identify the effect of indoxacarb on ABCG2 mRNA， the relative expression of ABCG2 mRNA in 3rdinstar larvae treated by indoxacarb was also analyzed. The results suggested that the expression of ABCG2 increased gradually over time. The results are helpful for further study of the relationship of ABCG2 expression and indoxacarb resistance in P. xylostella.
Key words Plutella xylostella； indoxacarb； ABCG2 mRNA； qRTPCR
小菜蛾[Plutella xylostella（L.）]属鳞翅目（Lepidoptera），菜蛾科（Plutellidae），一年发生多代，其繁殖率高，世代重叠现象严重，是鳞翅目昆虫中分布最广泛的害虫[1]。尽管人们做了大量工作制定和完善小菜蛾的综合防治策略[23]，但由于小菜蛾本身繁殖很快，加上全球范围内大量使用农药，加快了对其抗药性的选择[4]，导致小菜蛾对多种类型的农药产生了抗性并且抗药性越来越强，成为严重危害十字花科蔬菜作物的一种世界性害虫。茚虫威（indoxacarb）是由美国杜邦公司开发的二嗪类杀虫剂，由于其作用机制独特，对鳞翅目害虫具有卓越的杀虫活性，且对非靶标生物安全，成为替代有机磷类和拟除虫菊酯类杀虫剂防治鳞翅目害虫的理想品种[57]。ABC转运蛋白全称为ATP结合盒膜转运蛋白（ATPbinding cassette transporters），是一大类跨膜转运蛋白，共分7个亚家族（ABCA～ABCG），它们能够利用水解ATP产生的能量介导多种生物分子在细胞内外的运输[8]，降低细胞内生物分子的浓度，目前在医学领域研究比较多。多项报道称ABC基因家族的B、C、G亚族有介导药物转运的能力[912]，例如，P糖蛋白（基因符号ABCB1）、MRP1（基因符号ABCC1）、MRP2（基因符号ABCC2）和BCRP（基因符号ABCG2）跟药物抗药性有关，它们能够将有毒的外源物代谢并运送到细胞外[13]。鉴于ABC转运蛋白的重要性，研究者对一些昆虫，如果蝇、家蚕、粉纹夜蛾等体内的部分ABC转运蛋白进行了研究。
Labbé等从粉纹夜蛾和家蚕中分别获得B、C、G亚族的8、6、13条基因，分析了鳞翅目昆虫对杀虫剂等外源化合物的抗性，指出ABC转运蛋白可能起到显著的作用[14]。近年来，有报道称ABCC2与ABCB1分别与小菜蛾对Bt和阿维菌素的抗性相关[1516]。目前，已报道的昆虫ABCG2还很有限。ABCG2是一种半转运体，包括一个跨膜区域（transmembrane domain， TMD）和一个核酸结合区域（nucleotidebinding domain， NBD），是全转运体ABCB1、ABCC1、ABCC2结构域的一半，尽管与ABCB1、ABCC1和ABCC2在结构域上存在差异，但是在对药物的抗性中是同时发生作用的[14]。本试验比较了小菜蛾不同发育阶段ABCG2 mRNA相对表达量的差异，分析了4龄幼虫不同组织中的ABCG2 mRNA相对表达量的差异，以及茚虫威处理对ABCG2 mRNA相对表达量的影响，以期为以后研究茚虫威在小菜蛾体内代谢与ABCG2的关系提供参考。 1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 供试昆虫
小菜蛾敏感种群由湖南省农业科学院植物保护研究所提供，在温度为（28±1）℃，相对湿度60%～70%，光周期L∥D=16 h∥8 h的人工气候箱中用人工饲料喂养11代。成虫则以15%的蜂蜜水进行饲喂。
1.1.2 主要试剂和仪器
ABI 7300 Real Time PCR仪（美国ABI公司）；GZ800GSI人工气候箱，韶关市广智科技设备有限公司；茚虫威原药（indoxacarb，95%）上海悦联化工有限公司提供；RNA提取试剂TRIzol由美国 Invitrogen 公司生产；TransScriptTM AllinOne FirstStrand cDNA Synthesis SuperMix for PCR（AT321），购自北京全式金生物技术有限公司；SuperReal PreMix Plus （SYBR Green） 购自天根生化科技（北京）有限公司；其他试剂均为国产分析纯产品。
1.2 试验方法
1.2.1 不同发育期小菜蛾材料的准备
选取小菜蛾1～4龄幼虫以及蛹、雌性成虫、雄性成虫各3头，用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中备用，每个发育期4个生物学重复。
1.2.2 小菜蛾4龄幼虫不同组织部位材料的准备
在PBS缓冲液中解剖20头健康的4龄小菜蛾幼虫，获得小菜蛾的头、表皮、中肠、马氏管、精巢和其他残余物，将各组织在PBS缓冲液中清洗3次，然后用液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱中备用，每5头幼虫一组，每种组织包括4个生物学重复的样本。
1.2.3 茚虫威处理小菜蛾
为了检测在茚虫威刺激下，小菜蛾ABCG2在转录水平上的反应，将直径为6 cm的甘蓝叶片在0.43 mg/L茚虫威（该浓度为对敏感种群3日龄3龄幼虫的LC50）溶液中浸渍10 s，对照为不经药物处理的叶片，晾干后放置在底部铺有润湿滤纸的培养皿中，接入饥饿2 h的小菜蛾3龄幼虫，每皿20头活虫，放入人工气候培养箱中，在温度（28±1）℃，相对湿度60%～70%，光周期L∥D=16 h∥8 h下，分别喂养24、48、72 h，每个处理4个生物学重复，挑出存活的幼虫用液氮迅速冷却，放入-80 ℃冰箱中保存备用。
1.2.4 小菜蛾总RNA提取与cDNA第一链的合成
按照TRIzol（Invitrogen）试剂说明中的步骤分别提取不同龄期以及经茚虫威处理的小菜蛾总RNA和不同组织的RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，利用核酸检测仪检测RNA的纯度，合格后使用TransScriptTM AllinOne FirstStrand cDNA Synthesis SuperMix for PCR将RNA反转录合成cDNA第一链，产物于-20 ℃下保存备用。
1.2.5 引物的设计与合成以及内参基因的选择
根据小菜蛾基因组中的ABCG2基因序列设计特异性引物G2YGF和G2YGR（表1），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。将反转录获得的小菜蛾cDNA按10 倍梯度稀释（1、1/10、1/100、1/1 000、1/10 000）后作为模板，通过实时荧光PCR对引物的扩增效率进行检测，引物的扩增效率为96%符合定量试验要求。近几年研究表明，在实时荧光定量试验中，不同处理条件下的内参基因的表达存在一定的差异，所以，针对处理条件的不同，应选用相应条件下表达更稳定的内参基因[17]。因此本文在研究不同发育期、不同组织以及在茚虫威LC50浓度处理条件下ABCG2 mRNA表达量试验中，选用内参基因为延伸因子（elongation factor 1，EF1）、核糖体蛋白 L32（ribosomal protein L32， RPL32）和核糖体蛋白 S23（ribosomal protein S23，RPS23），详细信息见表1。
1.2.6 实时荧光定量PCR
按照SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）试剂盒说明进行加样，然后将样品置于ABI 7300 Real Time PCR仪进行扩增反应。扩增程序设置：95 ℃15 min； 95 ℃10 s，55 ℃20 s，72 ℃31 s，40个循环。每个样品设置4个独立的生物学重复，每个生物学重复设置4个技术重复。
1.3 试验数据的统计与分析
采用2-ΔΔCt法进行定量分析，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct 内参基因）处理-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照，通过SPSS软件进行差异显著性分析，LSD法进行多重比对，图表用Sigmaplot 12.0软件制作。
2 结果与分析
2.1 ABCG2 mRNA在不同发育阶段的相对表达量
根据图1所示可以看出，小菜蛾ABCG2 mRNA在不同发育阶段的相对表达量存在一定的差异。其中在雄性成虫中表达量最高，分别是3龄幼虫的5.63 倍、4龄的3.67 倍、蛹期7.36 倍、雌虫的3.51 倍。幼虫期ABCG2 mRNA的表达量随龄期增加无显著差异。
2.2 ABCG2 mRNA在4龄幼虫不同组织中的相对表达量
从图2可看出，小菜蛾4龄幼虫ABCG2 mRNA在中肠、马氏管、精巢、残余体相对表达量各不相同。其中在中肠中的相对表达量最高，分别是马氏管、精巢、残余体的3.12、8.96、7.33 倍，ABCG2 mRNA在头和表皮的表达量很低。
2.3 茚虫威处理对ABCG2 mRNA相对表达量的影响
如图3所示，在茚虫威的刺激下，小菜蛾3龄幼虫ABCG2 mRNA在转录水平呈现出相应的反应，表现为随处理时间增加表达量上升，而且在处理1、2、3 d时，表达量分别为同龄期无任何药剂处理组（处理方法同1.2.3）的2.16、4.32、6.76 倍。 3 讨论
越来越多的研究者意识到在实时荧光定量分析中使用1个内参基因容易产生系统误差，所以为了减少计算结果的系统误差，应选用2～3个内参基因，因此本试验选用了在生物因子和非生物因子条件下都表现出良好稳定性的3个内参基因EF1、RPL32和RPS23。ABCG2在小菜蛾不同发育阶段的表达模式与烟芽夜蛾体内ABC蛋白基因相似[18]，有报道称鳞翅目家蚕体内几种起代谢解毒作用的基因存在性别上的差异，这些基因在雌雄个体间表达量的差异导致代谢解毒能力在性别间存在差异[19]。本试验发现ABCG2 mRNA在小菜蛾雌雄个体间的表达量也存在差异，由于目前ABC类转运蛋白在鳞翅目昆虫中研究较少，所以该基因在雌雄个体间差异表达的原因有待进一步研究。小菜蛾ABCG2 mRNA在4龄幼虫的不同组织均有表达，其中在中肠的相对表达量最高，其次是马氏管，这与在家蚕中的研究结果一致[20]。而且，粉纹夜蛾幼虫的中肠、马氏管中与ABCG2基因功能相近的ABCB1基因的表达量很高[21]。这可能是由于中肠是昆虫十分重要的消化和吸收器官，马氏管是重要的排泄器官，这两个器官都跟外源物质的吸收和代谢有关，所以这两个部位ABCG2的高表达表明ABCG2可能在外源物质茚虫威的转运、吸收、代谢中起到一定的作用。生物体通过复杂的解毒系统来保护机体免受外源有毒物质的侵害。在代谢抗性中，有多种酶参与将有毒物质降解为低毒产物并促进产物排出机体外[22]。ABC跨膜转运蛋白可以自主结合有毒物质并将其转运出细胞。Tapadia等研究发现黑腹果蝇经过秋水仙素处理后，P糖蛋白（ABCB1）基因被诱导呈现高表达[21]。有报道称黑腹果蝇在高剂量的MRP的底物甲氨蝶呤毒素作用下，MRP1（基因符号ABCC1）直系同源物dMRP1被诱导高表达[23]。本试验也发现在茚虫威的刺激下，小菜蛾的ABCG2在转录水平呈现为表达量上升，而且，随着处理时间的增加，表达量不断升高，表明ABCG2对茚虫威刺激存在应激反应。这可能是因为小菜蛾的ABCG2参与了茚虫威在小菜蛾体内的转运，被茚虫威诱导所致，使其解毒代谢功能发挥了相应的作用。
本研究结果可为研究茚虫威在小菜蛾体内的代谢与ABCG2之间的关系提供参考，下一步可通过RNAi技术开展基因功能验证的工作，进一步研究ABCG2与昆虫抗药性之间的关系。
参考文献
[1]Talekar N S， Shelton A M.Biology， ecology， and management of the diamondback moth [J]. Annual Review of Entomology， 1993， 38：275301.
[2]Furlong M J， Wright D J， Dosdall L M.Diamondback moth ecology and management： problems， progress， and prospects[J]. Annual Review of Entomology， 2013， 58： 517541.
[3]Grzywacz D， Rossbach A， Rauf A， et al. Current control methods for diamondback moth and other brassica insect pests and the prospects for improved management with lepidopteranresistant Bt vegetable brassicas in Asia and Africa[J]. Crop Protection， 2010， 29（1）： 6879.
[4]Li Zhenyu， Zalucki M P， Bao Huali， et al. Population dynamics and “outbreaks” of diamondback moth （Lepidoptera： Plutellidae） in guangdong province， China： climate or failure of management [J]. Journal of Economic Entomology， 2012， 105（3）： 739752.
[5]Wing K D， Schnee M E， Sacher M， et al. A novel oxadiazine insecticide is bioactivated in lepidopteran larvae [J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 1998， 37（1）： 91103.
[6]Brévault T， Oumarou Y， Achaleke J， et al. Initial activity and persistence of insecticides for the control of bollworms （Lepidoptera： Noctuidae） in cotton crops[J]. Crop Protection， 2009， 28（5）： 401406.
[7]王建军，董红刚. 新型高效杀虫剂茚虫威毒理学研究进展[J]. 植物保护学报， 2009， 35（3）： 2022.
[8]Saurin W， Hofnung M， Dassa E. Getting in or out： early segregation between importers and exporters in the evolution of ATPbinding cassette （ABC） transporters [J]. Journal of Molecular Evolution， 1999， 48（1）： 2241. [9]Dean M， Hamon Y， Chimini G.The human ATPbinding cassette （ABC） transporter superfamily [J]. Journal of Lipid Research， 2001， 42（7）： 10071017.
[10]Dermauw W， Osborne E J， Clark R M， et al. A burst of ABC genes in the genome of the polyphagous spider mite Tetranychus urticae [J]. BMC Genomics， 2013， 14： 317.
[11]Sturm A， Cunningham P， Dean M.The ABC transporter gene family of Daphnia pulex [J].BMC Genomics，2009，10：170188.
[12]Sheps J A， Ralph S， Zhao Z， et al. The ABC transporter gene family of Caenorhabditis elegans has implications for the evolutionary dynamics of multidrug resistance in eukaryotes [J]. Genome Biology， 2004， 5（3）： R15.1R15.17.
[13]Leslie E M， Deeley R G， Cole S P C.Multidrug resistance proteins： role of Pglycoprotein， MRP1， MRP2， and BCRP （ABCG2） in tissue defense [J]. Toxicology and Applied Pharmacology， 2005， 204（3）： 216237.
[14]Labbe R， Caveney S， Donly C.Genetic analysis of the xenobiotic resistanceassociated ABC gene subfamilies of the Lepidoptera [J]. Insect Molecular Biology， 2011，20（2）： 243256.
[15]Baxter S W， BadenesPérez F R， Morrison A， et al. Parallel evolution of Bacillus thuringiensis toxin resistance in Lepidoptera [J]. Genetics， 2011， 189（2）： 675679.
[16]Luo Liang， Sun Yingjian， Wu Yijun.Abamectin resistance in Drosophila is related to increased expression of Pglycoprotein via the dEGFR and dAkt pathways [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2013， 43（8）： 627634.
[17]Fu Wei， Xie Wen， Zhang Zhuo， et al. Exploring valid reference genes for quantitative realtime PCR analysis in Plutella xylostella （Lepidoptera： Plutellidae） [J]. International Journal of Biological Sciences， 2013， 9（8）： 792802.
[18]Lanning C L， Fine R L， Corcoran J J， et al. Tobacco budworm Pglycoprotein： biochemical characterization and its involvement in pesticide resistance [J]. Biochimica et Biophysica ActaGeneral Subjects， 1996， 1291（2）： 155162.
[19]刘海涛， 李兵， 赵国栋， 等. 家蚕幼虫不同龄期体内主要解毒酶及其基因表达的性别差异[J]. 昆虫学报， 2010， 53（5）： 479486.
[20]戚伟平， 马小丽， 何玮毅， 等. 节肢动物ABC转运蛋白及其介导的杀虫剂抗性[J]. 昆虫学报， 2014， 57（6）： 729736.
[21]Tapadia M G， Lakhotia S C.Expression of mdr49 and mdr65 multidrug resistance genes in larval tissues of Drosophila melanogaster under normal and stress conditions [J]. Cell Stress