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摘要：目的研究洋甘菊提取物对宫颈癌Hela细胞体外增值抑制的作用。方法洋甘菊提取物95%乙醇提取并纯化，得到澄清的药物溶液后，进行细胞体外给药实验。采用CCK-8法测定不同浓度不同时间下洋甘菊提取物作用后Hela细胞存活率。结果药物浓度为670μg/mL时，Hela细胞抑制率为29.35%。当最高药物浓度达到1500μg/mL时，Hela细胞抑制率为82.18%。随着药物浓度的增加，Hela细胞抑制率呈明显上升趋势。结论维药洋甘菊提取物对宫颈癌Hela细胞的增殖有明显的抑制作用。
关键词：洋甘菊；宫颈癌；Hela细胞；细胞增殖；抑制
中图分类号：R285.6文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）05-0054-02
德国洋甘菊（Matricaria chamomilia）又称母菊，维吾尔语称“巴木乃”，是新疆特色地产药材[1]。根据近年来的药理学研究表明，发现它有镇静、止痛及改善癌症病人症状等作用[2]。
宫颈癌是一种严重危害妇女健康和生命的恶性肿瘤[3]。本实验组采用人宫颈癌Hela细胞作为实验模型，研究洋甘菊提取物体外抗宫颈癌的抑制活性，扩展洋甘菊的临床用途。
1材料
1.1药材洋甘菊于2015年采集自新疆和田地区策勒县策勒乡，经新疆医科大学中医学院中药系中药资源教研室盛萍教授鉴定为德国洋甘菊（Matricaria chamomilia）的头状花序。
1.2仪器酶标仪；显微镜，离心机，移液枪，超净工作台（BCM-1300A）；CO2培养箱（HERAcell 150i）。
1.3试剂0.25%胰酶（批号：140609，北京协和细胞资源中心）；胎牛血清（批号：20130511，兰州百灵生物技术有限公司）；DMEM培养液（批号：201305，Thermo Fisher公司）；CCK-8（批号：JA611，DOJINDO laboratories）。
1.4细胞人宫颈癌Hela细胞株由中国医学科学院药物研究所赠予。
2方法
2.1洋甘菊提取物的提取洋甘菊干燥花序2.0kg，加10倍量95 %乙醇浸泡30 min，加热回流2次，每次60 min，过滤，合并两次滤液，干燥，得到洋甘菊提取物。
2.2洋甘菊提取物药物溶液的配制洋甘菊提取物为粗提物，以DMSO助溶，用完全培养液稀释（DMSO含量≤0.5%），配制成每mL含2 mg洋甘菊提取物的溶液，完全溶解后于离心机中离心，转速12000 rpm，离心时间5 min，上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤，即得用于细胞给药的澄清药物溶液。
2.3细胞抑制率测定采用参考文献的方法[4]，选择处于对数生长期的细胞，在96孔细胞培养板中每孔接种3000 个/100 μL细胞悬液，24 h后给药，根据前期预试结果，分别设9个浓度受试组（能反映浓度与疗效的量-效关系）、阳性对照组、细胞对照组和正常组，阳性对照组加入顺铂（浓度为20 μg/mL）。同时，考察细胞毒性试验，加入上述不含药物的DMSO溶液，作为细胞对照组；加入正常培养基，作为正常组。再培养72 h，然后在细胞培养板中每孔加入100 μL CCK-8，在37℃环境中孵育4 h，然后测定其450 nm吸光度，获取受试药物对肿瘤细胞抑制率和IC50[5]。
2.4Hela细胞形态学观察根据上述细胞增殖抑制实验，取12孔板，加入浓度为890、670 μg/mL的药物，观察药物对细胞形态的影响。参照相关文献[6]，取对数生长期的Hela细胞接种于12孔细胞培养板内，每孔接种50000个/2 mL，培养24 h，实验组分别加入加入浓度为890、670 μg/mL的洋甘菊提取物，对照组加入空白培养液，培养72 h后在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。
3结果
3.1洋甘菊提取物对Hela细胞的增殖抑制作用采用CCK-8法测定分别加入1500、1200、1000、890、670、460、330、180、95 μg/mL不同浓度药物溶液作用72 h后Hela细胞的存活率，见图1。与对照组未经处理的Hela细胞相比，药物浓度为为890 μg/mL时，Hela细胞抑制率为51.16%。当最高药物浓度达到1500 μg/mL时，Hela细胞抑制率为82.18%。相同作用时间增加给药浓度，细胞抑制率明显上升。结果表明，洋甘菊提取物对Hela细胞的增殖有显著抑制作用。其中，IC50为890 μg/mL，对Hela细胞抑制率为51.16%。同时，将DMSO以完全培养液稀释后，DMSO的含量同给药组，经实验观察，DMSO对照组各浓度对细胞无明显抑制作用，并与正常组接近。
3.2Hela细胞形态学观察参照相关文献[6]，观察细胞的形态变化，见图2。
4讨论
本研究采用CCK-8法测定细胞存活率，结果表明，洋甘菊提取物可明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖。本实验对Hela细胞的活性进行检测，结果显示，Hela细胞的存活率随洋甘菊提取物给药浓度的增加而减小；综上所述，洋甘菊提取物能够抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖。
洋甘菊中含多种活性成分，最为重要成分的是黄酮类成分及其苷类成分，主要有芹菜素、木犀草素和槲皮素、木犀草苷等[7-8]，兰卫等[9-10]测定了芹苷元-7-葡萄糖苷和总皂苷的含量。
胡继松等[11]研究了芹菜中五种成分对肝癌细胞株HepG2、白血病细胞株HL-60的抑制效果。结果表明，芹菜素（98%）和芹菜醇提物（黄酮含量40%）样品对HepG2和HL-60有一定的抑制作用，而试验中芹菜粗黄酮（黄酮含量70%）、芹菜苷（98%）、3’-甲氧基芹菜苷（98%）对HepG2和HL-60这两种肿瘤细胞均无明显抑制效果。 天然药物通过多种途径对肿瘤进行预防和治疗，抗氧化作用是途径之一[12]。韩松林等报道了洋甘菊具有抗氧化作用[13]。夏娜等报道了洋甘菊中多糖与黄酮粗提物抗氧化及抑制亚硝化作用[14]。由于洋甘菊多成分，多靶点的特点，其提取物抗肿瘤作用机制广泛，洋甘菊抑制宫颈癌Hela细胞增殖作用的物质基础和可能的作用机制还有待进一步研究，其抑制宫颈癌Hela细胞增殖作用的“药—效”对应关系有待进一步明确。
参考文献：
[1]新疆卫生厅.维吾尔药标准（上册）[S].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1993：255.
[2]杨彦松，潘浪胜.洋甘菊中黄酮类成分的分离与结构确定[J].应用化工，2008，37（6）：696-697.
[3]陈丽春，毛建卫，龚金炎.洋甘菊中芹菜苷提取工艺研究[J].天然产物研究与开发，2013，25：986-989.
[4]许丽萍.CCK-8法检测AT#9对肿瘤细胞的生长抑制作用[J].北方药学，2012，9（1）：43-44.
[5]杜文娟，陈希元，闰秀玲.山核桃果皮提取物抗肿瘤活性研究[J].安徽农业科学，2012，40（5）：2912，3029.
[6]何杨，段斐，靳棉，等.山茱萸水提取物对Hela细胞体外增殖的影响[J].山东医药，2011，51（40）：83-84.
[7]Martins M D，Marques M M，Bussadori S K，et al.Comparative analysis between Chamomilla recutita and corticosteroids on wound healing An in vitro and in vivo study[J].Phytother Res，2009，23（2）：274-281.
[8]周伯庭，李新中.母菊的化学成分研究[J].湖南中医学院学报，2001，21：27-28.
[9]兰卫，郭玉婷，耿 直，等.洋甘菊中芹苷元-7-葡萄糖苷含量测定[J].新疆医科大学学报，2014，37（3）：303-305.
[10]兰卫，郭玉婷，耿 直，等.德国洋甘菊花序中总皂苷的含量测定[J].新疆医科大学学报，2014，37（3）：315-316.
[11]胡继松，陈静萍，陈亮，等.芹菜黄酮类物质降压降脂及抗肿瘤药理活性筛选[J].湖南农业科学，2014，（11）：9-12.
[12]张柯，马胜林.天然药物抗肿瘤机制的研究进展[J].中华中医药杂志，2011，26（10）：342-344.
[13]韩松林，李新霞，勉强辉，等.薄层生物自显影技术比较新疆2种洋甘菊抗氧化活性[J].中国中药杂志，2013，38（2）：193-198.
[14]夏娜，陶海燕，赵丽凤.洋甘菊中多糖与黄酮粗提物抗氧化及抑制亚硝化作用研究[J].食品工业，2014，35（11）：293-295.
关键词：洋甘菊；宫颈癌；Hela细胞；细胞增殖；抑制
中图分类号：R285.6文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）05-0054-02
德国洋甘菊（Matricaria chamomilia）又称母菊，维吾尔语称“巴木乃”，是新疆特色地产药材[1]。根据近年来的药理学研究表明，发现它有镇静、止痛及改善癌症病人症状等作用[2]。
宫颈癌是一种严重危害妇女健康和生命的恶性肿瘤[3]。本实验组采用人宫颈癌Hela细胞作为实验模型，研究洋甘菊提取物体外抗宫颈癌的抑制活性，扩展洋甘菊的临床用途。
1材料
1.1药材洋甘菊于2015年采集自新疆和田地区策勒县策勒乡，经新疆医科大学中医学院中药系中药资源教研室盛萍教授鉴定为德国洋甘菊（Matricaria chamomilia）的头状花序。
1.2仪器酶标仪；显微镜，离心机，移液枪，超净工作台（BCM-1300A）；CO2培养箱（HERAcell 150i）。
1.3试剂0.25%胰酶（批号：140609，北京协和细胞资源中心）；胎牛血清（批号：20130511，兰州百灵生物技术有限公司）；DMEM培养液（批号：201305，Thermo Fisher公司）；CCK-8（批号：JA611，DOJINDO laboratories）。
1.4细胞人宫颈癌Hela细胞株由中国医学科学院药物研究所赠予。
2方法
2.1洋甘菊提取物的提取洋甘菊干燥花序2.0kg，加10倍量95 %乙醇浸泡30 min，加热回流2次，每次60 min，过滤，合并两次滤液，干燥，得到洋甘菊提取物。
2.2洋甘菊提取物药物溶液的配制洋甘菊提取物为粗提物，以DMSO助溶，用完全培养液稀释（DMSO含量≤0.5%），配制成每mL含2 mg洋甘菊提取物的溶液，完全溶解后于离心机中离心，转速12000 rpm，离心时间5 min，上清液经0.22 μm无菌滤膜过滤，即得用于细胞给药的澄清药物溶液。
2.3细胞抑制率测定采用参考文献的方法[4]，选择处于对数生长期的细胞，在96孔细胞培养板中每孔接种3000 个/100 μL细胞悬液，24 h后给药，根据前期预试结果，分别设9个浓度受试组（能反映浓度与疗效的量-效关系）、阳性对照组、细胞对照组和正常组，阳性对照组加入顺铂（浓度为20 μg/mL）。同时，考察细胞毒性试验，加入上述不含药物的DMSO溶液，作为细胞对照组；加入正常培养基，作为正常组。再培养72 h，然后在细胞培养板中每孔加入100 μL CCK-8，在37℃环境中孵育4 h，然后测定其450 nm吸光度，获取受试药物对肿瘤细胞抑制率和IC50[5]。
2.4Hela细胞形态学观察根据上述细胞增殖抑制实验，取12孔板，加入浓度为890、670 μg/mL的药物，观察药物对细胞形态的影响。参照相关文献[6]，取对数生长期的Hela细胞接种于12孔细胞培养板内，每孔接种50000个/2 mL，培养24 h，实验组分别加入加入浓度为890、670 μg/mL的洋甘菊提取物，对照组加入空白培养液，培养72 h后在倒置显微镜下观察细胞的形态变化。
3结果
3.1洋甘菊提取物对Hela细胞的增殖抑制作用采用CCK-8法测定分别加入1500、1200、1000、890、670、460、330、180、95 μg/mL不同浓度药物溶液作用72 h后Hela细胞的存活率，见图1。与对照组未经处理的Hela细胞相比，药物浓度为为890 μg/mL时，Hela细胞抑制率为51.16%。当最高药物浓度达到1500 μg/mL时，Hela细胞抑制率为82.18%。相同作用时间增加给药浓度，细胞抑制率明显上升。结果表明，洋甘菊提取物对Hela细胞的增殖有显著抑制作用。其中，IC50为890 μg/mL，对Hela细胞抑制率为51.16%。同时，将DMSO以完全培养液稀释后，DMSO的含量同给药组，经实验观察，DMSO对照组各浓度对细胞无明显抑制作用，并与正常组接近。
3.2Hela细胞形态学观察参照相关文献[6]，观察细胞的形态变化，见图2。
4讨论
本研究采用CCK-8法测定细胞存活率，结果表明，洋甘菊提取物可明显抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖。本实验对Hela细胞的活性进行检测，结果显示，Hela细胞的存活率随洋甘菊提取物给药浓度的增加而减小；综上所述，洋甘菊提取物能够抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖。
洋甘菊中含多种活性成分，最为重要成分的是黄酮类成分及其苷类成分，主要有芹菜素、木犀草素和槲皮素、木犀草苷等[7-8]，兰卫等[9-10]测定了芹苷元-7-葡萄糖苷和总皂苷的含量。
胡继松等[11]研究了芹菜中五种成分对肝癌细胞株HepG2、白血病细胞株HL-60的抑制效果。结果表明，芹菜素（98%）和芹菜醇提物（黄酮含量40%）样品对HepG2和HL-60有一定的抑制作用，而试验中芹菜粗黄酮（黄酮含量70%）、芹菜苷（98%）、3’-甲氧基芹菜苷（98%）对HepG2和HL-60这两种肿瘤细胞均无明显抑制效果。 天然药物通过多种途径对肿瘤进行预防和治疗，抗氧化作用是途径之一[12]。韩松林等报道了洋甘菊具有抗氧化作用[13]。夏娜等报道了洋甘菊中多糖与黄酮粗提物抗氧化及抑制亚硝化作用[14]。由于洋甘菊多成分，多靶点的特点，其提取物抗肿瘤作用机制广泛，洋甘菊抑制宫颈癌Hela细胞增殖作用的物质基础和可能的作用机制还有待进一步研究，其抑制宫颈癌Hela细胞增殖作用的“药—效”对应关系有待进一步明确。
参考文献：
[1]新疆卫生厅.维吾尔药标准（上册）[S].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1993：255.
[2]杨彦松，潘浪胜.洋甘菊中黄酮类成分的分离与结构确定[J].应用化工，2008，37（6）：696-697.
[3]陈丽春，毛建卫，龚金炎.洋甘菊中芹菜苷提取工艺研究[J].天然产物研究与开发，2013，25：986-989.
[4]许丽萍.CCK-8法检测AT#9对肿瘤细胞的生长抑制作用[J].北方药学，2012，9（1）：43-44.
[5]杜文娟，陈希元，闰秀玲.山核桃果皮提取物抗肿瘤活性研究[J].安徽农业科学，2012，40（5）：2912，3029.
[6]何杨，段斐，靳棉，等.山茱萸水提取物对Hela细胞体外增殖的影响[J].山东医药，2011，51（40）：83-84.
[7]Martins M D，Marques M M，Bussadori S K，et al.Comparative analysis between Chamomilla recutita and corticosteroids on wound healing An in vitro and in vivo study[J].Phytother Res，2009，23（2）：274-281.
[8]周伯庭，李新中.母菊的化学成分研究[J].湖南中医学院学报，2001，21：27-28.
[9]兰卫，郭玉婷，耿 直，等.洋甘菊中芹苷元-7-葡萄糖苷含量测定[J].新疆医科大学学报，2014，37（3）：303-305.
[10]兰卫，郭玉婷，耿 直，等.德国洋甘菊花序中总皂苷的含量测定[J].新疆医科大学学报，2014，37（3）：315-316.
[11]胡继松，陈静萍，陈亮，等.芹菜黄酮类物质降压降脂及抗肿瘤药理活性筛选[J].湖南农业科学，2014，（11）：9-12.
[12]张柯，马胜林.天然药物抗肿瘤机制的研究进展[J].中华中医药杂志，2011，26（10）：342-344.
[13]韩松林，李新霞，勉强辉，等.薄层生物自显影技术比较新疆2种洋甘菊抗氧化活性[J].中国中药杂志，2013，38（2）：193-198.
[14]夏娜，陶海燕，赵丽凤.洋甘菊中多糖与黄酮粗提物抗氧化及抑制亚硝化作用研究[J].食品工业，2014，35（11）：293-295.