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摘要：从淫羊藿根、茎、叶分离出23株内生真菌，对分离出的真菌利用琼脂块法进行初选与滤纸片法进行复选，并以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea） 4 种微生物为指示菌对分离到的内生真菌进行抗菌活性检测。结果发现，分离得到的内生真菌中有10株菌株具较好的抑菌活性。对大肠埃希菌抑菌效果最好的为标号K7的菌株，抑菌圈直径为18.0 mm；对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果最好的均为标号B3的菌株，其抑菌圈直径分别为18.0、15.0 mm；而对灰霉病菌抑菌效果最好的为标号K6的菌株，其抑菌圈直径达到12.0 mm。
关键词：淫羊藿；内生真菌；抑菌活性
中图分类号：S482.2+92；Q939.9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0327-03
淫羊藿，为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿等多种淫羊藿的茎叶[1]，主产于贵州、辽宁等省[2-3]，夏、秋季采收，割取茎叶，除去杂质，晒干。淫羊藿茎叶含有淫羊藿苷和挥发油。中医学认为淫羊藿性味辛甘、温，有补肾壮阳、祛风除湿的功效；同时，淫羊藿还可以抑制血管运动中枢，扩张周围血管，使血压下降，对脊髓灰质炎病毒、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等有显著的抑制作用。淫羊藿在临床上主要用于治疗生殖、骨关节、呼吸系统疾病[4-5]。
植物内生真菌（endophyte fungus）是指在健康植物寄生的、在各种组织和器官内部或细胞间隙中进行部分或全部生活周期而不使宿主表现明显病理症状的一类真菌[6]。有研究发现，内生真菌普遍存在于植物组织内，并和宿主植物长期共生，与宿主在遗传、生理、代谢等方面相互渗透、同步进化，形成互利互惠的共生关系，使得它极有可能与宿主交换遗传信息，从而产生相似或相同生理活性的次级代谢产物[7]。1993年Stierle等从短叶红豆杉内生真菌中分离得到紫杉醇后，国内外学者从多种药用植物中陆续分离得到产生活性物质的内生真菌[6，8]，因此具有重要经济价值的药用植物内生真菌已成为筛选新药物的潜在资源[9-12]。
本试验以贵州省贵阳市郊的野生淫羊藿（Epimedium）为材料进行内生真菌的分离，并对其抗菌活性进行初步研究，以获得产生生物活性次生代谢产物的药用微生物，进而为新型抗菌物质的获得开辟一条新路径。
1 材料与方法
1.1 样品采集与内生真菌的分离
淫羊藿样品采自贵州省贵阳市郊。采集的新鲜植物样品4 ℃保存，72 h内处理。
1.2 供试指示菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea），均由贵州师范大学微生物实验室保存。
1.3 试验流程
淫羊藿内生真菌分离及抑菌活性试验流程见图1。
1.4 内生真菌的分离、纯化
将采集的新鲜样品用自来水洗净泥土等脏物，根、茎、叶分别切为0.5 cm的小片。在无菌条件下，对样本进行表面消毒，具体步骤如下：无菌水冲3次，Tween-20 处理30 s，8%次氯酸钠溶液消毒5 min，无菌水冲洗3 次，75%乙醇浸泡5 min，无菌水洗涤3次。同样无菌条件下将样本切成0.2 cm×0.2 cm 大小接种于PDA平板上，28 ℃培养至出现菌落，从菌落边缘取菌丝分别接种于新鲜平板，经反复转接得到纯化菌株，保藏待用[13]。
1.5 指示菌的培养
将枯草芽胞杆菌和大肠埃希菌的单菌落接种于5 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃培养18 h，将金黄色葡萄球菌单菌落接种于LB培养基，用无菌水制备浓度约为 2.2×105 CFU/mL 的菌悬液，灰霉病菌在PDB培养基里 28 ℃ 摇床振荡3 d，取100 μL 菌悬液接种于PDA固体培养基上，用玻璃环涂抹，进行抑菌试验。
1.6 抗菌活性菌株的初选
采用琼脂块法对所分离得到的内生真菌进行抗菌活性的初选，具体步骤如下：用打孔器从在PDA平板上生长的菌落上截取直径为6.0 mm的琼脂块，用无菌镊子将琼脂块放置于涂有指示菌的PDA平板上，28 ℃培养3 d，观察及测量抑菌圈直径[14]，重复3次。
1.7 抗菌活性菌株的复选
检测活性菌株发酵液的抑菌活性，作为活性菌株的复选方法，具体步骤如下：将初选菌株接种于100 mL PDB液体培养基中，28 ℃摇床培养8 d，4 000 r/min 离心15 min，收集上清，过滤除菌，用旋转蒸发仪将90 mL发酵液缩至1 mL。将纸片放在涂有指示菌的PDA平板上，点入20 μL发酵液在纸片上，28 ℃培养3 d，观察并测量抑菌圈的直径。
2 结果与分析
2.1 淫羊藿内生真菌分离结果
采用组织分离法从淫羊藿叶、茎、根中共分离得到23株菌落形态特征有差异的内生真菌，其中A类菌株有6株，B类有10株，K类有7株，试验部分菌株形态见图2，其生态学和分子生物学鉴定还有待研究。
2.2 淫羊藿内生真菌抑菌活性初步测定
用琼脂块法从23株内生真菌中初选抗菌活性较强的菌株。结果表明，A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株内生真菌对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和灰霉病菌均有一定的抑菌活性（表1）。
由表1可知，对大肠埃希菌抑菌效果最好的是K6、K7，抑菌圈直径分别达17.0、18.0 mm，其次是A4、B3、B8，抑菌圈直径为13.0 mm。B3对枯草芽孢杆菌抑菌圈直径达到 18.0 mm，效果最好。对金黄色葡萄球菌抑菌效果显著的是B3、K7、K6，抑菌圈直径分别为15.0、14.0、13.0 mm。对真菌指示菌灰霉病菌而言，K6抑制其生长的效果最好，抑菌圈直径为12.0 mm，其次，A3、B3、K7的抑菌效果也很好。 3 结论
本试验通过琼脂块法从淫羊藿中筛选得到了具有抗菌活性的A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株菌株，测定了其抑菌直径，根据初选试验可以得出结论：从不同指示菌株来看，对大肠埃希菌抑菌效果最好的是K6和K7；对枯草芽孢杆菌抑菌效果最好的是B3和K6；对金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳的是B3和K7；对灰霉病菌抑菌效果最好的是K6。对于内生真菌来说，A1对大肠埃希菌抑菌效果更好；A3对枯草芽孢杆菌抑菌效果不错；A4对大肠埃希菌抑菌效果更佳；B3对枯草芽孢杆菌抑菌效果更好；B7和B8、K8和K9对几种指示菌的抑菌效果相差不大；K6和K7对大肠埃希菌抑菌效果更佳。
在复选活性测定中有4株菌株具较好的抑菌活性，B3、B8、K9对灰霉病菌菌株有较强的抑菌活性，B3、B7则对大肠埃希菌抑菌活性明显，初步显示B3菌株有广谱的抑菌活性。对初选具抑菌活性的10种菌株的鉴定还有待进一步的分子试验。
植物内生真菌的特殊生境决定了其具有重要的农药和医药应用潜力，而具抗菌、抗肿瘤活性菌株丰富的次生代谢产物已成为药物来源新途径，必将在天然药物研究中得到开发与利用。试验证实，淫羊藿植物内生真菌丰富，分离的部分内生真菌菌株具明显的抗菌活性，对其活性成分进一步分离、分析，对新型药物的筛选具重要意义[15]。
参考文献：
[1]黄 辑. 神农本草经[M]. 北京：黄中医古藉出版杜，1982：192-193.
[2]吴其浚. 植物名实图考：卷6[M]. 北京：商务印书馆，1957：174.
[3]徐艳琴，李作舟，张学军，等. 三种药用淫羊藿的地理分布与资源调查[J]. 武汉植物学研究，2008，26（1）：91-98.
[4]何顺志，郭宝林. 贵州产淫羊藿的质量研究[J]. 药物分析杂志，1996，16（5）：291-294.
[5]Sturz A V，Nowak J. Endophytic communities of rhizobacteria and the strategies required to createyield enhancing associations with corps[J]. Applied Soil Ecology，2000，15（2）：183-190.
[6]Stierle A，Strobel G，Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science，1993，260（5105）：214-216.
[7]任安芝，高玉葆. 植物内生真菌——一类应用前景广阔的资源微生物[J]. 微生物学通报，2001，28（6）：90-93.
[8]李海燕，王志军，张玲琪，等. 一种桃儿七内生真菌的分离初报[J]. 云南大学学报：自然科学版，1999，21（3）：243.
[9]孙江山，张传博，乙 引，等.石斛属植物内生真菌的研究进展[J]. 江苏农业科学，2012，40（6）：348-351.
[10]林 敏，宁喜斌. 具抑菌活性海洋微生物的筛选[J]. 微生物学杂志，2005，25（5）：23-25.
[11]解修超，陈文强，邓百万，等. 药用裸子植物内生真菌研究现状与展望[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：10-14.
[12]彭 浩，陈文强，邓百万，等. 1株产白藜芦醇及白藜芦醇苷虎杖内生真菌的分离鉴定[J]. 江苏农业科学，2012，40（8）：342-345.
[13]郭建新，孙广宁，张 荣，等. 银杏内生真菌抗真菌活性菌株的分离和筛选[J]. 西北农业学报，2005，14（4）：14-17.
[14]王玉君，崔晋龙，苏 红，等. 远志内生真菌抑菌活性筛选[J]. 微生物学通报，2009，36（3）：404-411.
[15]严赞凯，邱 虎. 淫羊藿甙的抑菌试验[J]. 中国食品添加剂，2005（4）：65-67.
关键词：淫羊藿；内生真菌；抑菌活性
中图分类号：S482.2+92；Q939.9 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）03-0327-03
淫羊藿，为小檗科植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、巫山淫羊藿、朝鲜淫羊藿等多种淫羊藿的茎叶[1]，主产于贵州、辽宁等省[2-3]，夏、秋季采收，割取茎叶，除去杂质，晒干。淫羊藿茎叶含有淫羊藿苷和挥发油。中医学认为淫羊藿性味辛甘、温，有补肾壮阳、祛风除湿的功效；同时，淫羊藿还可以抑制血管运动中枢，扩张周围血管，使血压下降，对脊髓灰质炎病毒、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌等有显著的抑制作用。淫羊藿在临床上主要用于治疗生殖、骨关节、呼吸系统疾病[4-5]。
植物内生真菌（endophyte fungus）是指在健康植物寄生的、在各种组织和器官内部或细胞间隙中进行部分或全部生活周期而不使宿主表现明显病理症状的一类真菌[6]。有研究发现，内生真菌普遍存在于植物组织内，并和宿主植物长期共生，与宿主在遗传、生理、代谢等方面相互渗透、同步进化，形成互利互惠的共生关系，使得它极有可能与宿主交换遗传信息，从而产生相似或相同生理活性的次级代谢产物[7]。1993年Stierle等从短叶红豆杉内生真菌中分离得到紫杉醇后，国内外学者从多种药用植物中陆续分离得到产生活性物质的内生真菌[6，8]，因此具有重要经济价值的药用植物内生真菌已成为筛选新药物的潜在资源[9-12]。
本试验以贵州省贵阳市郊的野生淫羊藿（Epimedium）为材料进行内生真菌的分离，并对其抗菌活性进行初步研究，以获得产生生物活性次生代谢产物的药用微生物，进而为新型抗菌物质的获得开辟一条新路径。
1 材料与方法
1.1 样品采集与内生真菌的分离
淫羊藿样品采自贵州省贵阳市郊。采集的新鲜植物样品4 ℃保存，72 h内处理。
1.2 供试指示菌
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、灰霉病菌（Botrytis cinerea），均由贵州师范大学微生物实验室保存。
1.3 试验流程
淫羊藿内生真菌分离及抑菌活性试验流程见图1。
1.4 内生真菌的分离、纯化
将采集的新鲜样品用自来水洗净泥土等脏物，根、茎、叶分别切为0.5 cm的小片。在无菌条件下，对样本进行表面消毒，具体步骤如下：无菌水冲3次，Tween-20 处理30 s，8%次氯酸钠溶液消毒5 min，无菌水冲洗3 次，75%乙醇浸泡5 min，无菌水洗涤3次。同样无菌条件下将样本切成0.2 cm×0.2 cm 大小接种于PDA平板上，28 ℃培养至出现菌落，从菌落边缘取菌丝分别接种于新鲜平板，经反复转接得到纯化菌株，保藏待用[13]。
1.5 指示菌的培养
将枯草芽胞杆菌和大肠埃希菌的单菌落接种于5 mL 牛肉膏蛋白胨液体培养基，37 ℃培养18 h，将金黄色葡萄球菌单菌落接种于LB培养基，用无菌水制备浓度约为 2.2×105 CFU/mL 的菌悬液，灰霉病菌在PDB培养基里 28 ℃ 摇床振荡3 d，取100 μL 菌悬液接种于PDA固体培养基上，用玻璃环涂抹，进行抑菌试验。
1.6 抗菌活性菌株的初选
采用琼脂块法对所分离得到的内生真菌进行抗菌活性的初选，具体步骤如下：用打孔器从在PDA平板上生长的菌落上截取直径为6.0 mm的琼脂块，用无菌镊子将琼脂块放置于涂有指示菌的PDA平板上，28 ℃培养3 d，观察及测量抑菌圈直径[14]，重复3次。
1.7 抗菌活性菌株的复选
检测活性菌株发酵液的抑菌活性，作为活性菌株的复选方法，具体步骤如下：将初选菌株接种于100 mL PDB液体培养基中，28 ℃摇床培养8 d，4 000 r/min 离心15 min，收集上清，过滤除菌，用旋转蒸发仪将90 mL发酵液缩至1 mL。将纸片放在涂有指示菌的PDA平板上，点入20 μL发酵液在纸片上，28 ℃培养3 d，观察并测量抑菌圈的直径。
2 结果与分析
2.1 淫羊藿内生真菌分离结果
采用组织分离法从淫羊藿叶、茎、根中共分离得到23株菌落形态特征有差异的内生真菌，其中A类菌株有6株，B类有10株，K类有7株，试验部分菌株形态见图2，其生态学和分子生物学鉴定还有待研究。
2.2 淫羊藿内生真菌抑菌活性初步测定
用琼脂块法从23株内生真菌中初选抗菌活性较强的菌株。结果表明，A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株内生真菌对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和灰霉病菌均有一定的抑菌活性（表1）。
由表1可知，对大肠埃希菌抑菌效果最好的是K6、K7，抑菌圈直径分别达17.0、18.0 mm，其次是A4、B3、B8，抑菌圈直径为13.0 mm。B3对枯草芽孢杆菌抑菌圈直径达到 18.0 mm，效果最好。对金黄色葡萄球菌抑菌效果显著的是B3、K7、K6，抑菌圈直径分别为15.0、14.0、13.0 mm。对真菌指示菌灰霉病菌而言，K6抑制其生长的效果最好，抑菌圈直径为12.0 mm，其次，A3、B3、K7的抑菌效果也很好。 3 结论
本试验通过琼脂块法从淫羊藿中筛选得到了具有抗菌活性的A1、A3、A4、B3、B7、B8、K6、K7、K8、K9等10株菌株，测定了其抑菌直径，根据初选试验可以得出结论：从不同指示菌株来看，对大肠埃希菌抑菌效果最好的是K6和K7；对枯草芽孢杆菌抑菌效果最好的是B3和K6；对金黄色葡萄球菌抑菌效果最佳的是B3和K7；对灰霉病菌抑菌效果最好的是K6。对于内生真菌来说，A1对大肠埃希菌抑菌效果更好；A3对枯草芽孢杆菌抑菌效果不错；A4对大肠埃希菌抑菌效果更佳；B3对枯草芽孢杆菌抑菌效果更好；B7和B8、K8和K9对几种指示菌的抑菌效果相差不大；K6和K7对大肠埃希菌抑菌效果更佳。
在复选活性测定中有4株菌株具较好的抑菌活性，B3、B8、K9对灰霉病菌菌株有较强的抑菌活性，B3、B7则对大肠埃希菌抑菌活性明显，初步显示B3菌株有广谱的抑菌活性。对初选具抑菌活性的10种菌株的鉴定还有待进一步的分子试验。
植物内生真菌的特殊生境决定了其具有重要的农药和医药应用潜力，而具抗菌、抗肿瘤活性菌株丰富的次生代谢产物已成为药物来源新途径，必将在天然药物研究中得到开发与利用。试验证实，淫羊藿植物内生真菌丰富，分离的部分内生真菌菌株具明显的抗菌活性，对其活性成分进一步分离、分析，对新型药物的筛选具重要意义[15]。
参考文献：
[1]黄 辑. 神农本草经[M]. 北京：黄中医古藉出版杜，1982：192-193.
[2]吴其浚. 植物名实图考：卷6[M]. 北京：商务印书馆，1957：174.
[3]徐艳琴，李作舟，张学军，等. 三种药用淫羊藿的地理分布与资源调查[J]. 武汉植物学研究，2008，26（1）：91-98.
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[6]Stierle A，Strobel G，Stierle D. Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J]. Science，1993，260（5105）：214-216.
[7]任安芝，高玉葆. 植物内生真菌——一类应用前景广阔的资源微生物[J]. 微生物学通报，2001，28（6）：90-93.
[8]李海燕，王志军，张玲琪，等. 一种桃儿七内生真菌的分离初报[J]. 云南大学学报：自然科学版，1999，21（3）：243.
[9]孙江山，张传博，乙 引，等.石斛属植物内生真菌的研究进展[J]. 江苏农业科学，2012，40（6）：348-351.
[10]林 敏，宁喜斌. 具抑菌活性海洋微生物的筛选[J]. 微生物学杂志，2005，25（5）：23-25.
[11]解修超，陈文强，邓百万，等. 药用裸子植物内生真菌研究现状与展望[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：10-14.
[12]彭 浩，陈文强，邓百万，等. 1株产白藜芦醇及白藜芦醇苷虎杖内生真菌的分离鉴定[J]. 江苏农业科学，2012，40（8）：342-345.
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[14]王玉君，崔晋龙，苏 红，等. 远志内生真菌抑菌活性筛选[J]. 微生物学通报，2009，36（3）：404-411.
[15]严赞凯，邱 虎. 淫羊藿甙的抑菌试验[J]. 中国食品添加剂，2005（4）：65-67.