论文部分内容阅读
摘要 [目的]探讨一种测定噻菌灵的荧光传感新方法。[方法]通过10-甲基-3-硝基-吖啶酮（MAT）结合金胶构建荧光传感器建立了噻菌灵的荧光传感检测方法。[结果]在选定的试验条件下，噻菌灵荧光强度的恢复值与噻菌灵的浓度在500 nmol/L至8.0 μmol/L范围内成良好的线性关系，检测限为60 nmol/L。[结论]该方法简便、快速、灵敏，具有重要的实际应用价值。
关键词 噻菌灵；荧光；金胶；MAT
中图分类号 S482.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）04-131-03
噻菌灵（TBZ）属苯并咪唑类杀菌剂，是高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂，在农业生产中广泛使用，也常用作竹木产品的防霉剂。因此，TBZ常在农产品及竹木产品中残留，严重影响生态环境和人类健康。随着对外贸易的增加，各国对我国农产品及竹木产品的技术壁垒越来越苛刻。国内外对噻菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的残留量十分重视，并制定了其残留限量标准，最低残留限量达0.05 mg/kg（即2.485 μmol/L）[1]。目前TBZ的测定方法主要有色谱和质谱联用法[2-8]等，但该类方法仪器昂贵，操作复杂。因此，研究一种更简便可靠的TBZ检测新方法十分必要。为此，笔者通过MAT结合金胶构建荧光传感器建立了一种测定TBZ的荧光传感新方法，旨在为苯并咪唑类杀菌剂的残留量测定提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器。
Cary Eclipse荧光光谱仪（安捷伦科技有限公司）；1 cm石英比色皿；pHS-3B型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；超纯水系统（Millipore Milli-Q）。
1.1.2 试剂。40 nm纳米金（百灵威科技有限公司）。MAT（自制合成[9]）的表征数据如下：C，66.22%；H，4.12%；N，11.02%（计算值：C，66.14%；H，3.94%；N，11.02%）；IR（KBr）ν：2970，2860（υCH3），1584（υC-C），1650（υC1/4C），1380（υC-NO2）。MS：m/z 255（[M+1]+）。1H NMR（CDCl3，δ）7.82（d，ArH），7.64（s，ArH），7.62（t，ArH），7.48（d，ArH），6.92（d，ArH），6.76（t，ArH），6.50（d，ArH），2.72（m，CH3）。
噻菌灵标准品（含量99.0%）为Dr.Ehrenstorfer GmbH产品。其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 噻菌灵标准溶液的配制。称取0.005 0 g噻菌灵标准品，用甲醇溶解转移至25 ml容量瓶中，定容，即配制成1×10-3 mol/L噻菌灵母液。临用时，再用相应缓冲液稀释至所需浓度。
1.2.2 试验方法。将MAT用水稀释至1×10-3 mol/L，而后用PBS（pH7.5）稀释至5×10-5 mol/L，从中吸取1 ml于1 cm比色皿中，加入100 μl纳米金和100 μl一系列浓度的噻菌灵。在440 nm激发波长下，于460～580 nm范围内扫描荧光光谱。
2 结果与分析
2.1 检测原理 检测机理是将MAT结合金胶作为荧光信号传感元件，构建用于TBZ检测的荧光传感器。在一定条件下，MAT与纳米金通过静电作用结合在一起，发生FRET，使MAT的发光猝灭（荧光关）。在噻菌灵存在情况下，噻菌灵通过金巯键与金胶发生共价结合，形成更稳定的结构，从而减弱了金胶与MAT之间的结合能力，使MAT游离，体系荧光恢复（荧光开）。利用MAT在纳米金和TBZ存在下的荧光“关开”性质，实现TBZ的特异灵敏检测（图1）。
2.2 光谱法验证传感方法的可行性 由图2所示，纳米金在可见光区有一个强的表面等离子体吸收带（λmax=521 nm，曲线a），MAT的最大发射波长是500 nm（曲线b），接近纳米金的最大吸收波长，且MAT的激发光谱与纳米金的吸收光谱也有部分重叠，所以当MAT与纳米金共存时，会发生能量共振转移，使MAT的荧光猝灭。用荧光法验证传感器的可行性。结果如图3所示，MAT在λ=500 nm发出较强的荧光（曲线c），加入纳米金后，由于纳米金与MAT的相互作用，从而发生能量共振转移，荧光猝灭（曲线a）。在TBZ存在下，TBZ与纳米金发生共价结合，形成更稳定的结构，从而减弱了纳米金与MAT之间的猝灭作用，使DSA的荧光增强（曲线b）。据此拟定了测定TBZ的新方法，试验证明该方法是可行的。
2.3 传感方法的性能研究
2.3.1 检测条件优化。
首先，考察不同pH对体系荧光增强△F的影响。结果发现在pH小于7.5和大于7.5时荧光恢复效果不明显，在pH为7.5时荧光恢复效果最好。因此，选择最佳pH为7.5。
其次，考察了MAT溶液浓度变化对体系荧光增强△F的影响，MAT溶液浓度从0.1 μmol/L变化到0.1 mmol/L。试验证明当体系中的MAT浓度为50.0 μmol/L时，荧光增强程度最大且处于一个较稳定的状态。因而选取体系中MAT溶液的浓度为50.0 μmol/L。还考察了结合时间对检测体系的影响，结果表明纳米金、MAT、TBZ共存时，MAT的荧光强度静置20 min后达到最大值且基本稳定，所以选择静置时间为20 min。
2.3.2 TBZ线性范围。
最佳条件下，对一系列浓度的TBZ进行定量检测，观察荧光强度变化。结果表明，随着TBZ浓度不断增加，MAT荧光强度也随之增大，在500 nmol/L至8.0 μmol/L范围内，MAT荧光强度恢复值与TBZ浓度成良好的线性关系（图4和图5），回归方程为：△F=227.52 log（C）-559.71，r=0.992 1。检测限达到60 nmol/L。 2.3.3 抗干扰试验。
考察了常见的金属离子K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Al3+、Fe3+、Td3+、Cr3+等对MAT荧光强度的影响程度。结果表明，Fe3+对MAT的荧光猝灭效果较明显，其他离子影响不明显。因此，Fe3+对MAT荧光强度有干扰，可加入掩蔽剂如EDTA消除Fe3+的干扰。
3 结论
由于试验构建的荧光传感新方法使用的是非标记型检测技术，无需繁杂的标记过程，极大减少了测试成本，消除了对于质谱等昂贵仪器的需要。此外，与目前常用的方法相比，该检测方法灵敏度高、选择性好、响应速度快且无需表面修饰，操作更加简便，表现了重要的实际应用价值。
参考文献
[1] 唐月新.现行有效国内外食品中农兽药残留限量标准实用手册[M].北京：中国科学技术出版社，2005.
[2] PROUSALLS K P，POLYGENIS D A，SYROKOU A，et al.Determination of carbendazim，thiabendazole，and ophenylphenol residues in lemons by HPLC following sample clean-up by ion-pairing[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2004，379（3）：458-463.
[3] 刘晓松，童张法，郑玲，等.固相萃取-高效液相色谱法同时测定噻菌灵和多菌灵在浓缩菠萝汁中的残留量[J].分析科学学报，2007，23（3）：311-314.
[4] 胡彦学，杨秀敏，王志，等.固相微萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定番茄中的多菌灵和噻菌灵[J].色谱，2005，23（6）：581-584.
[5] GRUJIC S，RADISIC M，VASILJEVIC T.Determination of carbendazim residues in fruit juices by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Food Additives and Contaminants，2005，22（11）：1132-1137.
[6] OREA J M，BESCOS B，MONTERO C，et al.Analysis of carbendazim in agricultural samples by laser desorption and REMPI time-of- flight mass spectrometry[J].Analytical Chemistry，1998，70（3）：491-497.
[7] TJAN G H，JANSEN J T.Gas-liquid chromatographic determination of thiabendazole and methyl 2-benzimidazole carbamate in fruits and crops[J].Journal of the Association of Official Analytical Chemists，1979，62（4）：769-773.
[8] 吴永江，朱炜，程翼宇.液-质联用法测定石斛和西洋参及制剂中多菌灵残留[J].分析化学，2006，34（2）：235-238.
[9] CHEN J H，ZHANG X，CAI S X，et al.Label-free electrochemical biosensor using home-made 10-methyl-3-nitro-acridone as indicator for picomolar detection of nuclear factor kappaB[J].Biosensors and Bioelectronics，2014，53：12-17.
关键词 噻菌灵；荧光；金胶；MAT
中图分类号 S482.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）04-131-03
噻菌灵（TBZ）属苯并咪唑类杀菌剂，是高效、低毒和广谱的内吸性杀菌剂，在农业生产中广泛使用，也常用作竹木产品的防霉剂。因此，TBZ常在农产品及竹木产品中残留，严重影响生态环境和人类健康。随着对外贸易的增加，各国对我国农产品及竹木产品的技术壁垒越来越苛刻。国内外对噻菌灵等苯并咪唑类杀菌剂的残留量十分重视，并制定了其残留限量标准，最低残留限量达0.05 mg/kg（即2.485 μmol/L）[1]。目前TBZ的测定方法主要有色谱和质谱联用法[2-8]等，但该类方法仪器昂贵，操作复杂。因此，研究一种更简便可靠的TBZ检测新方法十分必要。为此，笔者通过MAT结合金胶构建荧光传感器建立了一种测定TBZ的荧光传感新方法，旨在为苯并咪唑类杀菌剂的残留量测定提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 仪器。
Cary Eclipse荧光光谱仪（安捷伦科技有限公司）；1 cm石英比色皿；pHS-3B型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；超纯水系统（Millipore Milli-Q）。
1.1.2 试剂。40 nm纳米金（百灵威科技有限公司）。MAT（自制合成[9]）的表征数据如下：C，66.22%；H，4.12%；N，11.02%（计算值：C，66.14%；H，3.94%；N，11.02%）；IR（KBr）ν：2970，2860（υCH3），1584（υC-C），1650（υC1/4C），1380（υC-NO2）。MS：m/z 255（[M+1]+）。1H NMR（CDCl3，δ）7.82（d，ArH），7.64（s，ArH），7.62（t，ArH），7.48（d，ArH），6.92（d，ArH），6.76（t，ArH），6.50（d，ArH），2.72（m，CH3）。
噻菌灵标准品（含量99.0%）为Dr.Ehrenstorfer GmbH产品。其他试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 噻菌灵标准溶液的配制。称取0.005 0 g噻菌灵标准品，用甲醇溶解转移至25 ml容量瓶中，定容，即配制成1×10-3 mol/L噻菌灵母液。临用时，再用相应缓冲液稀释至所需浓度。
1.2.2 试验方法。将MAT用水稀释至1×10-3 mol/L，而后用PBS（pH7.5）稀释至5×10-5 mol/L，从中吸取1 ml于1 cm比色皿中，加入100 μl纳米金和100 μl一系列浓度的噻菌灵。在440 nm激发波长下，于460～580 nm范围内扫描荧光光谱。
2 结果与分析
2.1 检测原理 检测机理是将MAT结合金胶作为荧光信号传感元件，构建用于TBZ检测的荧光传感器。在一定条件下，MAT与纳米金通过静电作用结合在一起，发生FRET，使MAT的发光猝灭（荧光关）。在噻菌灵存在情况下，噻菌灵通过金巯键与金胶发生共价结合，形成更稳定的结构，从而减弱了金胶与MAT之间的结合能力，使MAT游离，体系荧光恢复（荧光开）。利用MAT在纳米金和TBZ存在下的荧光“关开”性质，实现TBZ的特异灵敏检测（图1）。
2.2 光谱法验证传感方法的可行性 由图2所示，纳米金在可见光区有一个强的表面等离子体吸收带（λmax=521 nm，曲线a），MAT的最大发射波长是500 nm（曲线b），接近纳米金的最大吸收波长，且MAT的激发光谱与纳米金的吸收光谱也有部分重叠，所以当MAT与纳米金共存时，会发生能量共振转移，使MAT的荧光猝灭。用荧光法验证传感器的可行性。结果如图3所示，MAT在λ=500 nm发出较强的荧光（曲线c），加入纳米金后，由于纳米金与MAT的相互作用，从而发生能量共振转移，荧光猝灭（曲线a）。在TBZ存在下，TBZ与纳米金发生共价结合，形成更稳定的结构，从而减弱了纳米金与MAT之间的猝灭作用，使DSA的荧光增强（曲线b）。据此拟定了测定TBZ的新方法，试验证明该方法是可行的。
2.3 传感方法的性能研究
2.3.1 检测条件优化。
首先，考察不同pH对体系荧光增强△F的影响。结果发现在pH小于7.5和大于7.5时荧光恢复效果不明显，在pH为7.5时荧光恢复效果最好。因此，选择最佳pH为7.5。
其次，考察了MAT溶液浓度变化对体系荧光增强△F的影响，MAT溶液浓度从0.1 μmol/L变化到0.1 mmol/L。试验证明当体系中的MAT浓度为50.0 μmol/L时，荧光增强程度最大且处于一个较稳定的状态。因而选取体系中MAT溶液的浓度为50.0 μmol/L。还考察了结合时间对检测体系的影响，结果表明纳米金、MAT、TBZ共存时，MAT的荧光强度静置20 min后达到最大值且基本稳定，所以选择静置时间为20 min。
2.3.2 TBZ线性范围。
最佳条件下，对一系列浓度的TBZ进行定量检测，观察荧光强度变化。结果表明，随着TBZ浓度不断增加，MAT荧光强度也随之增大，在500 nmol/L至8.0 μmol/L范围内，MAT荧光强度恢复值与TBZ浓度成良好的线性关系（图4和图5），回归方程为：△F=227.52 log（C）-559.71，r=0.992 1。检测限达到60 nmol/L。 2.3.3 抗干扰试验。
考察了常见的金属离子K+、Na+、Mg2+、Zn2+、Pb2+、Cu2+、Hg2+、Al3+、Fe3+、Td3+、Cr3+等对MAT荧光强度的影响程度。结果表明，Fe3+对MAT的荧光猝灭效果较明显，其他离子影响不明显。因此，Fe3+对MAT荧光强度有干扰，可加入掩蔽剂如EDTA消除Fe3+的干扰。
3 结论
由于试验构建的荧光传感新方法使用的是非标记型检测技术，无需繁杂的标记过程，极大减少了测试成本，消除了对于质谱等昂贵仪器的需要。此外，与目前常用的方法相比，该检测方法灵敏度高、选择性好、响应速度快且无需表面修饰，操作更加简便，表现了重要的实际应用价值。
参考文献
[1] 唐月新.现行有效国内外食品中农兽药残留限量标准实用手册[M].北京：中国科学技术出版社，2005.
[2] PROUSALLS K P，POLYGENIS D A，SYROKOU A，et al.Determination of carbendazim，thiabendazole，and ophenylphenol residues in lemons by HPLC following sample clean-up by ion-pairing[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2004，379（3）：458-463.
[3] 刘晓松，童张法，郑玲，等.固相萃取-高效液相色谱法同时测定噻菌灵和多菌灵在浓缩菠萝汁中的残留量[J].分析科学学报，2007，23（3）：311-314.
[4] 胡彦学，杨秀敏，王志，等.固相微萃取-高效液相色谱-荧光检测法测定番茄中的多菌灵和噻菌灵[J].色谱，2005，23（6）：581-584.
[5] GRUJIC S，RADISIC M，VASILJEVIC T.Determination of carbendazim residues in fruit juices by liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Food Additives and Contaminants，2005，22（11）：1132-1137.
[6] OREA J M，BESCOS B，MONTERO C，et al.Analysis of carbendazim in agricultural samples by laser desorption and REMPI time-of- flight mass spectrometry[J].Analytical Chemistry，1998，70（3）：491-497.
[7] TJAN G H，JANSEN J T.Gas-liquid chromatographic determination of thiabendazole and methyl 2-benzimidazole carbamate in fruits and crops[J].Journal of the Association of Official Analytical Chemists，1979，62（4）：769-773.
[8] 吴永江，朱炜，程翼宇.液-质联用法测定石斛和西洋参及制剂中多菌灵残留[J].分析化学，2006，34（2）：235-238.
[9] CHEN J H，ZHANG X，CAI S X，et al.Label-free electrochemical biosensor using home-made 10-methyl-3-nitro-acridone as indicator for picomolar detection of nuclear factor kappaB[J].Biosensors and Bioelectronics，2014，53：12-17.