【摘 要】
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目的 利用超声激励微泡促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)目的 基因表达,为组织修复提供细胞水平基础.方法 构建并提取bFGF目的 基因质粒,其含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作
【机 构】
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武汉市第三医院超声科,湖北武汉430060;武汉市第三医院烧伤科,湖北武汉430060
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目的 利用超声激励微泡促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)目的 基因表达,为组织修复提供细胞水平基础.方法 构建并提取bFGF目的 基因质粒,其含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为标记基因,制备并鉴定含bFGF-EGFP基因微泡.将细胞成功分离、培养后,在不同实验条件下(质粒质量浓度、声强、辐照时间和占空比)进行超声激励微泡参数优化,根据每组条件下最优的细胞存活率和标记基因转染效率所对应的参数作为后续实验超声辐照条件.实验分为4组:A组为对照组,B组为单纯bFGF-EGFP质粒组,C组为超声辐照+普通脂质微泡组,D组为超声辐照+bFGF-EGFP微泡组.细胞转染24h后,在倒置荧光显微镜下观察EGFP表达情况;转染48 h后,用流式细胞仪检测转染效率,CCK8法检测细胞存活率,逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和Western blot分别检测mRNA和蛋白的相对表达量,并比较4组间的差异来评价超声激励bFGF微泡在细胞水平的生物学效应.结果 携带bFG F-EG FP质粒微泡粒径大小约为(941.7±101.2) nm,Zeta电位大小约为(20.8±4.5) mV.实验研究中最优超声参数为质粒质量浓度20 μg/mL,声强1.50 W/cm2,辐照时间60s,占空比40％.细胞转染24h后,A组和C组未见明显EGFP表达,B组有少量EGFP表达,而D组EGFP表达量明显增多.转染48 h后,4组细胞存活率均＞80％,各组间差异无统计学意义(P＞0.05).流式细胞仪测量转染效率在D组[(60.0±7.9)％]较其他各组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).转染48 h后,超声激励目的 基因bFGF转染后D组mRNA[(45.0±5.1)％]和蛋白相对表达量[(35.0±5.0)％]均明显增高,而D组Ⅰ型胶原蛋白[(9.1±3.0)％]和Ⅲ型胶原蛋白[(11.2±3.1)％]较其他组均明显降低,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 超声优化参数激励bFGF微泡可提高细胞转染效率并保持较高的细胞活性,促进bFGF表达效率并抑制Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白;这种超声物理效应和bFGF生物效应相结合的方式为皮肤组织在细胞水平修复提供了新策略.
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