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摘 要 MEE70/MSI1是拟南芥母性效应胚胎滞育基因，在植物胚胎发生过程中具有重要作用。采用RACE技术获得龙眼MEE70-1a（登录号KC492117）及其可变剪接体MEE70-1b（登录号KC492118）cDNA序列，克隆MSI1 gDNA（登录号KC492126）序列。生物信息学分析预测DlMEE70-1a和DlMEE70-1b均为亲水不稳定的酸性蛋白，主要定位于过氧化物酶体和细胞核，各含有4和1个WD-repeat结构域。MEE70-1a和MEE70-1b在体细胞胚胎发生过程实时荧光定量PCR分析结果表明，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b表达趋势以心形胚为界，除了DlMEE70-1b的不完全胚型紧实结构（ICpEC）到球形胚（GE）阶段之间，都表现出先降后升的趋势；胚性愈伤组织（EC）时期两者表达量一致且最高；心形胚（HE）时期，两者表达量一致且最低，另DlMEE70-1b在不完全胚性紧实结构（ICpEC）表达量与心形胚基本一致。这2个表达剂量是胚胎发生的重要保障，心形胚（HE）后，DlMEE70-1a被再次激活转录促进胚胎正常发育。从DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的理化性质、WD重复结构域数量、亚细胞定位以及表达量和趋势，可以推测DlMEE70-1a需要DlMEE70-1b的协同来调控龙眼胚胎发育。
关键词 龙眼；体胚发生；MEE70/MSI1；母性效应；可变剪接；qPCR
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Gene Cloning of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b of MEE70/MSI1
from Embryogenic Callus and Their Expression Analysis During
Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.
LU Bingguo， LIAN Conglong， LAI Zhongxiong*
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract MEE70/MSI1， a maternal effect embryo arrest gene in Arabidopsis， plays an important role in plant embryogenesis. In the present study， the full-length cDNA sequences of DlMEE70-1a gene（Accession number： KC492117）and its alternative splicing DlMEE70-1b（Accession number： KC492118）were obtained by RT-PCR combined with RACE techniques， while the gDNA sequence of MSI1 gene（Accession number： KC492126）was also obtained. Bioinformatics analysis indicated that both of the proteins encoded by DlMEE70-1a and DlMEE70-1b were of unstable hydrophilic and acidic proteins，mainly located in peroxisomes and the nucleus and containing 4 WD-repeat domains and 1 WD-repeat domain，respectively. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis demonstrated that， during the somatic embryogenesis， the expression levels of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b wre bounded at the stage of the heart-shaped embryo and displayed the trend of first-decreasing-then-rising， except for DlMEE70-1b during the period of development from the incomplete compact pro-embryogenic cultures to globular embryos. High expression of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b in the friable-embryogenic callus was important for embryogenesis，The transcription of DlMEE70-1a was activated after the heart embryo. It was interesting that DlMEE70-1a and DlMEE70-1b had the similar physical and chemical properties， the same subcellular localization and the similar expression levels and trends. Therefore， it was inferred that DlMEE70-1b was coupled with DlMEE70-1a， possessed the coordinated regulation during the embryogenesis of longan. This study provided some new clues to the elaboration of the molecular mechanism of maternal effect genes DlMEE70 in the process of somatic embryogenesis. Key words Dimocarpus longan； Somatic embryogenesis； MEE70/MSI1；Maternal effect； Alternative splicing； qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.011
MEE（maternal effect embryo arrest）是Pagnussat 等[1]通过Ac/Ds转座子系统筛选拟南芥雌性生殖缺陷突变体群，发现该突变体群自花授粉或授以野生型花粉，后代都有50%左右种子败育，体现出母性效应基因遗传特征，遗传分析确定MEE70和MSI1属于同一基因。MSI1蛋白是WD40重复蛋白成员之一，一般只存在于真核生物，是保守的组蛋白绑定蛋白[2]。MSI1蛋白是染色质排列因子CAF-1的亚基[3-5]，其还存在于RBR、CUL4-DDB1等多个染色质修饰蛋白复合体，控制印记基因表达和关闭[6-7]。MSI1是多梳抑制蛋白复合体PRC2的亚基，在拟南芥中有3个类型PRC2，植物发育中起重要调控作用[8]。“非受精种子”FIS2- PRC2[9-10]阻止非受精的胚乳形成，抑制受精后胚乳和胚胎增殖；“春化”VRN-PRC2[11-12]和“萌发期开花”EMF-PRC2[13-15]都控制孢子体发育的各个方面，VRN-PRC2通过表观修饰抑制FLC表达，促进冷诱导开花；EMF-PRC2抑制重要开花调节因子FT和AG，抑制过早开花。
MSI1是自主开花基因之一，其蛋白参与SOC1染色质的组蛋白H3K4双甲基化和H3K9乙酰化的表观修饰，导致SOC1高表达，从而促进拟南芥适时开花[16]。拟南芥MSI1在上游调控开花促进基因CO-FT途径，能产生有效光周期反应和诱导开花[17]。此外，MSI1还抑制拟南芥干旱胁迫反应[18]。与MEE70突变体一样，Kohler等[9]研究结果表明拟南芥T-DNA突变体msi1也表现出母性效应遗传特征，突变体在受精之前就启动胚乳发育，合子胚被二倍体的胚乳包围，这可能导致胚胎败育。MSI1转基因共抑制植株AtMSI1-CS，MSI1表达量减少，胚珠发育被严重破坏，导致雌性不育[19]。
龙眼（Drimocarpus longan Lour.）是无患子科的热带亚热带的特色水果，具有较高的经济价值，培育类似近缘属荔枝焦核品种，是研究人员长期以来一直追求的目标[20]。MEE作为母性效应胚胎滞育基因，对于果树胚胎和果实发育有非常重要意义，可为培育小核或无核的果树品种奠定基础。由于植物胚胎被胚珠包围，早期胚胎很难被分离或观察，必须借助显微手段，研究难度较大，目前这个方面研究仅限于模式植物，在果树或多年生木本植物上尚未见报道。对于培育龙眼这类水果的焦核品种，主要在于让胚胎在早中期败育，因此研究早中期胚胎的分子机制，对于龙眼育种有重要的意义。同步化调控的龙眼体胚发生体系是理想的实验系统，它克服了合子胚基因型不一致，发育程度不一致，早中期活体胚胎难取样等问题，因而它可以代替合子胚用来研究木本植物的胚胎发育[21]。因此，本研究采用龙眼体胚发生系统，结合龙眼胚性愈伤组织的转录组数据库设计引物，进行分离与拟南芥母性效应基因同源的龙眼MEE70基因，采用实时荧光定量PCR方法研究其在龙眼体细胞胚发育各个阶段的表达情况。
1 材料与方法
1.1 材料
经过同步化的龙眼（Dimocarpus longan Lour.）体胚发生不同阶段的胚性培养物：松散型胚性愈伤组织（Friable embryogenic callus， EC）、不完全胚性紧实结构（Incomplete compact pro-embryogenic cultures， ICpEC）、球形胚（Globular embryos， GE）、心形胚（Heart embryos， HE）、鱼雷形胚（Topedo embryos， TE）、早期子叶形胚（Early cotyledonary embryos， ECE），均来自红核子品种LC2细胞系[21]；龙眼胚性愈伤组织的转录组数据库（SRR accession number：SRA050205）。
1.2 方法
1.2.1 总RNA和DNA的提取及模板的合成 龙眼体胚发生6个不同发育时期的胚性培养物RNA提取采用Tripure Isolation Reagent（Roche）试剂盒；3′RACE、5′RACE和ORF模板cDNA合成采用GeneRacerTM Kit（Invitrogen）；实时荧光定量模板cDNA合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaLa）；龙眼基因组DNA提取采用改良CTAB法。
1.2.2 引物的设计及PCR扩增 根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库中的MEE70片段设计3′RACE和5′RACE的2条正向和两条反向基因特异引物分别与GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，进行巢式PCR反应扩增3′端和5′端。将所获得的序列片段进行拼接，设计验证引物并扩增MEE70的ORF。同时，以龙眼胚性愈伤组织的DNA为模板，用DlMEE70-1a的ORF引物PCR扩增基因组序列。引物设计及序列分析采用DNAMAN6.0，引物委托华大基因公司合成。本研究中使用的引物见表1。
PCR反应体系和扩增程序参照赖呈纯等[22]的方法，根据扩增不同的目的片段，对PCR扩增程序进行相应的调整。获得目的片段后切胶回收，TA克隆后挑取阳性克隆子的菌液进行PCR扩增，将有目的条带的菌液送至华大基因公司测序。
1.2.3 DlMEE70生物信息学分析 DNAMAN6.0软件进行序列拼接和分析；GSDS在线软件进行内含子和外显子分析；ExPASy Protparam预测蛋白理化性质；SignalP 4.1、EMBnet TMpred、PlantLoc预测蛋白质信号肽、跨膜区段和亚细胞定位；蛋白的保守结构域和功能区、二级及三级结构的预测分别使用NCBI-CDS和Prosite、SOPMA和SWISS-MODEL在线软件；NetPhos 2.0在线软件进行磷酸化位点预测；MEGA5.02（Neighbor-Joining）软件构建分子系统进化树，重复检测1 000次。 1.2.4 qPCR扩增 本试验以6个不同发育阶段的龙眼体胚为材料，采用TaKaRa SYBR ExScript试剂和罗氏LightCycler 480仪器，检测DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的定量PCR试验，分析两种转录本在龙眼体胚发生不同发育阶段中的表达情况。qPCR反应体系和扩增程序参照Lin and Lai[23]的方法，首先以龙眼体胚6个不同发育阶的cDNA混合模板样进行5 倍梯度系列稀释制作标准曲线，每个反应进行3次重复，待反应结束后进行扩增曲线、融解曲线（60～95 ℃）和凝胶电泳分析，检测转录本DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的各自对应引物DlMEE70-1a-qF/DlMEE-70-1a-qR和DlMEE70-1b-qF/DlMEE70-1b-qR特异性。
1.3 数据分析
根据Lin and Lai[23]建立的多基因内参体系，以EIF4ɑ、EF-1ɑ和FSD三基因为内参，采用Excel和geNORM（version 3.5）[24]软件进行数据分析，计算DlMEE70-1a和DlMEE70-1b基因相对表达量。
2 结果与分析
2.1 龙眼DlMEE70 cDNA全长的扩增及序列分析
经过巢式PCR扩增获得DlMEE70的3′和5′两端特异片段，测序结果表明：DlMEE70两个带有polyA尾巴的3′-RACE片段大小分别为1 088 bp和782 bp，两者靠近5′端有518 bp相同碱基，有不同3′端片段； 5′-RACE片段大小为1 028 bp。初步判断这是来自同一个基因的可变剪接体。经DNAMAN6.0软件拼接，5′-RACE片段和1 088 bp 3′-RACE片段，完全吻合，得到DlMEE70-1a cDNA全长为1 432 bp；5′-RACE片段和782 bp 3′-RACE 2个片段，5′端有在517 bp相同碱基，去掉不同5′-RACE 167 bp 3′端片段，加上3′-RACE 3′端264 bp，得到1个1 126 bp DlMEE70-1b cDNA。设计特异引物进行cDNA序列拼接验证和DNA序列扩增，测序结果显示：DlMEE70-1a与DlMEE70-1b拼接验证的序列分别为1 361 bp和916 bp，核苷酸序列与拼接结果完全相同。
2.2 龙眼DlMEE70基因组序列扩增及内含子分析
经过PCR扩增获得1条3 700 bp DlMEE70的基因组序列，测序结果表明：DlMEE70 gDNA全长为3 676 bp，它与DlMEE70-1a、DlMEE70-1b序列比对的结果如图1所示，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b来源于同一个基因的可变剪接。基因组与DlMEE70-1a序列比对结果表明，基因组由6个内含子和7个外显子组成，其内含子剪切位点符合真核生物GT-AG规则。外显子的长度依次为376、327、153、122、96、224、63 bp；内含子的长度个别波动相对较大，分别为86、122、673、181、279、974 bp，内含子3和6相对于其他内含子，长度较长，占该基因组长度的18.3%和26.5%。DlMEE70-1b与基因组比对结果表明，DlMEE70-1b是由基因组第1、2和3个外显子和部分第3个内含子序列组成，第3个内含子应含有1个弱终止子信号，终止了基因的转录。
2.3 龙眼胚性愈伤组织DlMEE70基因编码蛋白的生物信息学分析
2.3.1 蛋白质的理化性质分析 ExPASy ProtParam预测结果表明，DlMEE70-1a蛋白由430个氨基酸组成，分子式为C2185H3325N587O679S16，总原子数为6 792，相对分子质量为49 193.9；由 20种氨基酸组成，其中以亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最丰富为39个，比例达到9.1%，其次是天冬氨酸（Asp）占8.4%；该蛋白不稳定系数为48.42，总平均疏水性为-0.541，所带负电的氨基酸（Asp+Glu）和正电的氨基酸（Arg+Lys）数分别为75和39个，理论等电点为4.75 ；而DlMEE70-1b由DlMEE70-1a N端前 276个氨基酸和另外2个氨基酸组成，该蛋白不稳定系数为46.71，总平均疏水性为-0.509，带正、负电的氨基酸数分别为45和27个，理论等电点为5.02。综上分析，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b都是不稳定的、亲水的酸性蛋白质，它们的理化性质相近，可能参与类似的代谢反应。
SignalP 4.1、EMBnet TMpred和PlantLoc预测结果表明，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b不属于分泌蛋白或者跨膜蛋白，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b主要定位于过氧化物酶体和细胞核，也有可能定位于叶绿体、线粒体、内质网和液泡（图2）。
2.3.2 蛋白质结构特征分析 NCBI-CDS在线分析DlMEE70-1a保守结构域，该蛋白存在CAF1C_H4-bd和WD40保守结构域，并分别属于CAF1C_H4-bd和WD40超家族（图3）。通过Prosite进一步分析，该蛋白存在4个WD重复单元的蛋白，分别位于174-216、269-304、312-354和369-403（图4）。而DlMEE70-1b蛋白仅保留CAF1C_H4-bd结构域和1个位于174-216的WD结构域。
通过SOPMA对DlMEE70-1a的二维结构进行预测，如图5所示DlMEE70-1a蛋白由16.05%的α-螺旋，29.30%的延伸链，4.88%的β-转角和49.77%的随机卷曲组成。延伸链和不规则盘绕是DlMEE70-1a蛋白最大量的结构元件，而α-螺旋主要分布在蛋白质N端和C端，β转角则散布于整个蛋白质中。 通过软件SWISS-MODEL的Automated Model进行三级结构预测，DlMEE70-1a与果蝇CAF1组蛋白绑定蛋白[25]的氨基酸相似性高达65.66%，因而以它的结晶体结构为模型构建DlMEE70-1a三维结构（图6），从图上可见，DlMEE70-1a螺旋卷曲主要存在于蛋白N端和C端，之后均由不规则盘和延伸链贯穿整体，与二级结构预测相符。DlMEE70-1b具有DlMEE70-1a的靠近N端部分二级结构，在二级结构基础折叠的蛋白高级结构还有待进一步确定。
2.3.3 氨基酸磷酸化修饰预测 经NetPhos 2.0分析，结果如图7所示，DlMEE70-1a存在21个潜在的磷酸化位点，分布于整条多肽链中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点数分别是11、3和7，DlMEE70-1b只拥有靠近DlMEE70-1a N端7个丝氨酸和6个酪氨酸的磷酸化位点数，龙眼DlMEE70-1a和DlMEE70-1b丰富的磷酸化位点意味着它们可参与生物体内多种代谢途径反应，它们可能拥有多种功能。
2.4 龙眼胚性愈伤组织DlMEE70-1a基因编码的蛋白质同源性和进化分析
同源序列比对结果显示，DlMEE70-1a氨基酸序列与原始生物藻类植物的团藻、莱茵衣藻和蕨类植物江南卷柏相似性分别为65.51%、65.05%和72.23%；与裸子植物北美云杉、玉米、水稻和拟南芥相似性分别为80.74%、80.32%、81.38%和81.21%；与同源物种荔枝的同源性更是高达98.60%。该基因与其他物种氨基酸具有高度同源性，说明基因功能在进化中的保守性。
采用Mega5.02近邻相接法NJ分析15个不同物种的MEE70进化树，如图8所示，其中原始生物藻类和蕨类被归为一类，裸子植物北美云杉与被子植物被分开归类，被子植物的单子叶植物和双子叶植物各归为一类。此外，同为无患子科的龙眼与荔枝被归为一类。因此，从该进化树上可以看出，该基因的进化符合经典的物种进化过程。
2.5 龙眼体胚发生过程DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的表达模式分析
DlMEE70-1a和DlMEE70-1b实时荧光定量分析结果如图9所示，DlMEE70-1a在体胚发生过程的表达总趋势为先降后升，从胚性愈伤组织（EC）、不完全胚型紧实结构（ICpEC）、球形胚（GE）和心形胚（HE），表达量均逐渐下降，呈平稳下降趋势；从心形胚（HE）到鱼雷形胚（TE）阶段，呈明显上升趋势；从鱼雷形胚（TE）到早期子叶型胚（ECE）阶段，其表达量没有明显变化。DlMEE70-1b在体胚发生过程表达量波动较大，其在EC最高急剧下降，至ICpEC最低，呈急剧下降趋势；ICpEC到GE阶段，表达量呈上升趋势；从GE到HE阶段呈现下降趋势，HE表达量与ICpEC基本一致；从HE到TE阶段，表达量没有明显变化；从TE到ECE阶段，表达量呈现明显上升趋势。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b表达趋势以HE为界，除了DlMEE70-1b的ICpEC到GE这个阶段，都表现出先下降，而后上升的趋势。除了ICpEC和TE，通过DlMEE70-1b与DlMEE70-1a表达量在其他4个时期相对表达量基本一致，且两者在EC相对表达量最高。
3 讨论
3.1 DlMEE70基因可变剪接
可变剪接是用不同方式剪接pre-mRNA产生各种各样的mRNA，在多细胞真核生物中广泛存在。在模式植物拟南芥的多个器官有41%～60%的多外显子基因存在可变剪接体，内含子驻留是拟南芥可变剪接显著特征[26]，其中65%内含子驻留出现部分开放阅读框，在非翻译区或者最后一个内含子，它们不参与NMD无义介导的衰变[27]。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b来自同一条基因组，与DlMEE70-1a基因相比，DlMEE70-1b插入第3个部分内含子，使基因转录提前终止，开放阅读框变短，它不参与NMD无义介导的衰变。DlMEE70-1b在龙眼植株中表达情况，有助于进一步了解可变剪接功能。
3.2 生物信息学推测DlMEE70蛋白可能作用机制
DlMEE70-1a和DlMEE70-1b主要定位于过氧化物酶体和细胞核，也有可能定位于叶绿体、线粒体、内质网和液泡。过氧化物酶体发生或功能的缺陷，会导致种子不能萌发、植株矮小、胚胎败育[28]。DlMEE70或过氧化酶体都与胚胎发育相关，两者之间通过何种途径来调控胚胎发育还有待进一步的研究。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b各具有4和1个WD结构域，而拟南芥MEE70具有5个WD结构域，这意味着DlMEE70-1a需要DlMEE70-1b协同互作。龙眼DlMEE70可参与多种细胞器代谢，而拟南芥MEE70主要定位于细胞核和叶绿体， 龙眼DlMEE70应具有更复杂的代谢途径和功能。
3.3 DlMEE70-1a和DlMEE70-1b在龙眼体胚发生过程中的协同互作
MEE70作为母性效应基因之一，在体胚发生过程中的调控起着重要的作用。拟南芥msi1败育胚胎中MEE70基因仅在雌配子体形成过程转录，支撑后期的受精卵和合子胚发育。拟南芥msi1败育胚胎有36%停滞在球形胚前或者球形胚，有50%停滞在心形胚，只有少数心形胚继续分裂增殖而不进行分化，说明MEE70具有调控胚胎细胞的分裂和分化的功能，尤其是细胞的分化[2，9]。储备于卵细胞中MEE70 mRNA及其蛋白，基本上能满足合子胚生长发育到心形胚，心形胚之后必须重新启动MEE70基因转录，才能维持胚胎的生长发育。龙眼DlMEE70-1a与拟南芥MEE70在胚胎发育表达趋势一致，具有典型的母性效应基因特点，是调控龙眼胚胎发育关键基因。
DlMEE70-1b和DlMEE70-1a两者在4个时期相对表达量基本一致，且DlMEE70-1b不完全胚性紧实结构表达量最低与DlMEE70-1a在心形胚最低表达量基本一致，暗示这个剂量DlMEE70基因浓度是龙眼体胚发生过程能忍受最低极限浓度；当DlMEE70-1b和DlMEE70-1a比例浓度不一致，转录机制就会启动转录DlMEE70-1b，使其达到DlMEE70-1a一致的比例浓度，这都暗示DlMEE70-1b协同DlMEE70-1a调控龙眼胚胎发育。与DlMEE70-1a平稳下降不同，DlMEE70-1b从胚性愈伤组织最高点急剧下降到不完全胚性紧实结构阶段最低点，可以推测DlMEE70-1b还具有其他功能。 参考文献
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关键词 龙眼；体胚发生；MEE70/MSI1；母性效应；可变剪接；qPCR
中图分类号 S667.2 文献标识码 A
Gene Cloning of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b of MEE70/MSI1
from Embryogenic Callus and Their Expression Analysis During
Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longan Lour.
LU Bingguo， LIAN Conglong， LAI Zhongxiong*
Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China
Abstract MEE70/MSI1， a maternal effect embryo arrest gene in Arabidopsis， plays an important role in plant embryogenesis. In the present study， the full-length cDNA sequences of DlMEE70-1a gene（Accession number： KC492117）and its alternative splicing DlMEE70-1b（Accession number： KC492118）were obtained by RT-PCR combined with RACE techniques， while the gDNA sequence of MSI1 gene（Accession number： KC492126）was also obtained. Bioinformatics analysis indicated that both of the proteins encoded by DlMEE70-1a and DlMEE70-1b were of unstable hydrophilic and acidic proteins，mainly located in peroxisomes and the nucleus and containing 4 WD-repeat domains and 1 WD-repeat domain，respectively. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis demonstrated that， during the somatic embryogenesis， the expression levels of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b wre bounded at the stage of the heart-shaped embryo and displayed the trend of first-decreasing-then-rising， except for DlMEE70-1b during the period of development from the incomplete compact pro-embryogenic cultures to globular embryos. High expression of DlMEE70-1a and DlMEE70-1b in the friable-embryogenic callus was important for embryogenesis，The transcription of DlMEE70-1a was activated after the heart embryo. It was interesting that DlMEE70-1a and DlMEE70-1b had the similar physical and chemical properties， the same subcellular localization and the similar expression levels and trends. Therefore， it was inferred that DlMEE70-1b was coupled with DlMEE70-1a， possessed the coordinated regulation during the embryogenesis of longan. This study provided some new clues to the elaboration of the molecular mechanism of maternal effect genes DlMEE70 in the process of somatic embryogenesis. Key words Dimocarpus longan； Somatic embryogenesis； MEE70/MSI1；Maternal effect； Alternative splicing； qPCR
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.01.011
MEE（maternal effect embryo arrest）是Pagnussat 等[1]通过Ac/Ds转座子系统筛选拟南芥雌性生殖缺陷突变体群，发现该突变体群自花授粉或授以野生型花粉，后代都有50%左右种子败育，体现出母性效应基因遗传特征，遗传分析确定MEE70和MSI1属于同一基因。MSI1蛋白是WD40重复蛋白成员之一，一般只存在于真核生物，是保守的组蛋白绑定蛋白[2]。MSI1蛋白是染色质排列因子CAF-1的亚基[3-5]，其还存在于RBR、CUL4-DDB1等多个染色质修饰蛋白复合体，控制印记基因表达和关闭[6-7]。MSI1是多梳抑制蛋白复合体PRC2的亚基，在拟南芥中有3个类型PRC2，植物发育中起重要调控作用[8]。“非受精种子”FIS2- PRC2[9-10]阻止非受精的胚乳形成，抑制受精后胚乳和胚胎增殖；“春化”VRN-PRC2[11-12]和“萌发期开花”EMF-PRC2[13-15]都控制孢子体发育的各个方面，VRN-PRC2通过表观修饰抑制FLC表达，促进冷诱导开花；EMF-PRC2抑制重要开花调节因子FT和AG，抑制过早开花。
MSI1是自主开花基因之一，其蛋白参与SOC1染色质的组蛋白H3K4双甲基化和H3K9乙酰化的表观修饰，导致SOC1高表达，从而促进拟南芥适时开花[16]。拟南芥MSI1在上游调控开花促进基因CO-FT途径，能产生有效光周期反应和诱导开花[17]。此外，MSI1还抑制拟南芥干旱胁迫反应[18]。与MEE70突变体一样，Kohler等[9]研究结果表明拟南芥T-DNA突变体msi1也表现出母性效应遗传特征，突变体在受精之前就启动胚乳发育，合子胚被二倍体的胚乳包围，这可能导致胚胎败育。MSI1转基因共抑制植株AtMSI1-CS，MSI1表达量减少，胚珠发育被严重破坏，导致雌性不育[19]。
龙眼（Drimocarpus longan Lour.）是无患子科的热带亚热带的特色水果，具有较高的经济价值，培育类似近缘属荔枝焦核品种，是研究人员长期以来一直追求的目标[20]。MEE作为母性效应胚胎滞育基因，对于果树胚胎和果实发育有非常重要意义，可为培育小核或无核的果树品种奠定基础。由于植物胚胎被胚珠包围，早期胚胎很难被分离或观察，必须借助显微手段，研究难度较大，目前这个方面研究仅限于模式植物，在果树或多年生木本植物上尚未见报道。对于培育龙眼这类水果的焦核品种，主要在于让胚胎在早中期败育，因此研究早中期胚胎的分子机制，对于龙眼育种有重要的意义。同步化调控的龙眼体胚发生体系是理想的实验系统，它克服了合子胚基因型不一致，发育程度不一致，早中期活体胚胎难取样等问题，因而它可以代替合子胚用来研究木本植物的胚胎发育[21]。因此，本研究采用龙眼体胚发生系统，结合龙眼胚性愈伤组织的转录组数据库设计引物，进行分离与拟南芥母性效应基因同源的龙眼MEE70基因，采用实时荧光定量PCR方法研究其在龙眼体细胞胚发育各个阶段的表达情况。
1 材料与方法
1.1 材料
经过同步化的龙眼（Dimocarpus longan Lour.）体胚发生不同阶段的胚性培养物：松散型胚性愈伤组织（Friable embryogenic callus， EC）、不完全胚性紧实结构（Incomplete compact pro-embryogenic cultures， ICpEC）、球形胚（Globular embryos， GE）、心形胚（Heart embryos， HE）、鱼雷形胚（Topedo embryos， TE）、早期子叶形胚（Early cotyledonary embryos， ECE），均来自红核子品种LC2细胞系[21]；龙眼胚性愈伤组织的转录组数据库（SRR accession number：SRA050205）。
1.2 方法
1.2.1 总RNA和DNA的提取及模板的合成 龙眼体胚发生6个不同发育时期的胚性培养物RNA提取采用Tripure Isolation Reagent（Roche）试剂盒；3′RACE、5′RACE和ORF模板cDNA合成采用GeneRacerTM Kit（Invitrogen）；实时荧光定量模板cDNA合成采用PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaLa）；龙眼基因组DNA提取采用改良CTAB法。
1.2.2 引物的设计及PCR扩增 根据龙眼胚性愈伤组织转录组数据库中的MEE70片段设计3′RACE和5′RACE的2条正向和两条反向基因特异引物分别与GeneRacerTM 3′Primer和GeneRacerTM 3′Nested Primer引物，进行巢式PCR反应扩增3′端和5′端。将所获得的序列片段进行拼接，设计验证引物并扩增MEE70的ORF。同时，以龙眼胚性愈伤组织的DNA为模板，用DlMEE70-1a的ORF引物PCR扩增基因组序列。引物设计及序列分析采用DNAMAN6.0，引物委托华大基因公司合成。本研究中使用的引物见表1。
PCR反应体系和扩增程序参照赖呈纯等[22]的方法，根据扩增不同的目的片段，对PCR扩增程序进行相应的调整。获得目的片段后切胶回收，TA克隆后挑取阳性克隆子的菌液进行PCR扩增，将有目的条带的菌液送至华大基因公司测序。
1.2.3 DlMEE70生物信息学分析 DNAMAN6.0软件进行序列拼接和分析；GSDS在线软件进行内含子和外显子分析；ExPASy Protparam预测蛋白理化性质；SignalP 4.1、EMBnet TMpred、PlantLoc预测蛋白质信号肽、跨膜区段和亚细胞定位；蛋白的保守结构域和功能区、二级及三级结构的预测分别使用NCBI-CDS和Prosite、SOPMA和SWISS-MODEL在线软件；NetPhos 2.0在线软件进行磷酸化位点预测；MEGA5.02（Neighbor-Joining）软件构建分子系统进化树，重复检测1 000次。 1.2.4 qPCR扩增 本试验以6个不同发育阶段的龙眼体胚为材料，采用TaKaRa SYBR ExScript试剂和罗氏LightCycler 480仪器，检测DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的定量PCR试验，分析两种转录本在龙眼体胚发生不同发育阶段中的表达情况。qPCR反应体系和扩增程序参照Lin and Lai[23]的方法，首先以龙眼体胚6个不同发育阶的cDNA混合模板样进行5 倍梯度系列稀释制作标准曲线，每个反应进行3次重复，待反应结束后进行扩增曲线、融解曲线（60～95 ℃）和凝胶电泳分析，检测转录本DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的各自对应引物DlMEE70-1a-qF/DlMEE-70-1a-qR和DlMEE70-1b-qF/DlMEE70-1b-qR特异性。
1.3 数据分析
根据Lin and Lai[23]建立的多基因内参体系，以EIF4ɑ、EF-1ɑ和FSD三基因为内参，采用Excel和geNORM（version 3.5）[24]软件进行数据分析，计算DlMEE70-1a和DlMEE70-1b基因相对表达量。
2 结果与分析
2.1 龙眼DlMEE70 cDNA全长的扩增及序列分析
经过巢式PCR扩增获得DlMEE70的3′和5′两端特异片段，测序结果表明：DlMEE70两个带有polyA尾巴的3′-RACE片段大小分别为1 088 bp和782 bp，两者靠近5′端有518 bp相同碱基，有不同3′端片段； 5′-RACE片段大小为1 028 bp。初步判断这是来自同一个基因的可变剪接体。经DNAMAN6.0软件拼接，5′-RACE片段和1 088 bp 3′-RACE片段，完全吻合，得到DlMEE70-1a cDNA全长为1 432 bp；5′-RACE片段和782 bp 3′-RACE 2个片段，5′端有在517 bp相同碱基，去掉不同5′-RACE 167 bp 3′端片段，加上3′-RACE 3′端264 bp，得到1个1 126 bp DlMEE70-1b cDNA。设计特异引物进行cDNA序列拼接验证和DNA序列扩增，测序结果显示：DlMEE70-1a与DlMEE70-1b拼接验证的序列分别为1 361 bp和916 bp，核苷酸序列与拼接结果完全相同。
2.2 龙眼DlMEE70基因组序列扩增及内含子分析
经过PCR扩增获得1条3 700 bp DlMEE70的基因组序列，测序结果表明：DlMEE70 gDNA全长为3 676 bp，它与DlMEE70-1a、DlMEE70-1b序列比对的结果如图1所示，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b来源于同一个基因的可变剪接。基因组与DlMEE70-1a序列比对结果表明，基因组由6个内含子和7个外显子组成，其内含子剪切位点符合真核生物GT-AG规则。外显子的长度依次为376、327、153、122、96、224、63 bp；内含子的长度个别波动相对较大，分别为86、122、673、181、279、974 bp，内含子3和6相对于其他内含子，长度较长，占该基因组长度的18.3%和26.5%。DlMEE70-1b与基因组比对结果表明，DlMEE70-1b是由基因组第1、2和3个外显子和部分第3个内含子序列组成，第3个内含子应含有1个弱终止子信号，终止了基因的转录。
2.3 龙眼胚性愈伤组织DlMEE70基因编码蛋白的生物信息学分析
2.3.1 蛋白质的理化性质分析 ExPASy ProtParam预测结果表明，DlMEE70-1a蛋白由430个氨基酸组成，分子式为C2185H3325N587O679S16，总原子数为6 792，相对分子质量为49 193.9；由 20种氨基酸组成，其中以亮氨酸（Leu）和谷氨酸（Glu）含量最丰富为39个，比例达到9.1%，其次是天冬氨酸（Asp）占8.4%；该蛋白不稳定系数为48.42，总平均疏水性为-0.541，所带负电的氨基酸（Asp+Glu）和正电的氨基酸（Arg+Lys）数分别为75和39个，理论等电点为4.75 ；而DlMEE70-1b由DlMEE70-1a N端前 276个氨基酸和另外2个氨基酸组成，该蛋白不稳定系数为46.71，总平均疏水性为-0.509，带正、负电的氨基酸数分别为45和27个，理论等电点为5.02。综上分析，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b都是不稳定的、亲水的酸性蛋白质，它们的理化性质相近，可能参与类似的代谢反应。
SignalP 4.1、EMBnet TMpred和PlantLoc预测结果表明，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b不属于分泌蛋白或者跨膜蛋白，DlMEE70-1a和DlMEE70-1b主要定位于过氧化物酶体和细胞核，也有可能定位于叶绿体、线粒体、内质网和液泡（图2）。
2.3.2 蛋白质结构特征分析 NCBI-CDS在线分析DlMEE70-1a保守结构域，该蛋白存在CAF1C_H4-bd和WD40保守结构域，并分别属于CAF1C_H4-bd和WD40超家族（图3）。通过Prosite进一步分析，该蛋白存在4个WD重复单元的蛋白，分别位于174-216、269-304、312-354和369-403（图4）。而DlMEE70-1b蛋白仅保留CAF1C_H4-bd结构域和1个位于174-216的WD结构域。
通过SOPMA对DlMEE70-1a的二维结构进行预测，如图5所示DlMEE70-1a蛋白由16.05%的α-螺旋，29.30%的延伸链，4.88%的β-转角和49.77%的随机卷曲组成。延伸链和不规则盘绕是DlMEE70-1a蛋白最大量的结构元件，而α-螺旋主要分布在蛋白质N端和C端，β转角则散布于整个蛋白质中。 通过软件SWISS-MODEL的Automated Model进行三级结构预测，DlMEE70-1a与果蝇CAF1组蛋白绑定蛋白[25]的氨基酸相似性高达65.66%，因而以它的结晶体结构为模型构建DlMEE70-1a三维结构（图6），从图上可见，DlMEE70-1a螺旋卷曲主要存在于蛋白N端和C端，之后均由不规则盘和延伸链贯穿整体，与二级结构预测相符。DlMEE70-1b具有DlMEE70-1a的靠近N端部分二级结构，在二级结构基础折叠的蛋白高级结构还有待进一步确定。
2.3.3 氨基酸磷酸化修饰预测 经NetPhos 2.0分析，结果如图7所示，DlMEE70-1a存在21个潜在的磷酸化位点，分布于整条多肽链中，丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的磷酸化位点数分别是11、3和7，DlMEE70-1b只拥有靠近DlMEE70-1a N端7个丝氨酸和6个酪氨酸的磷酸化位点数，龙眼DlMEE70-1a和DlMEE70-1b丰富的磷酸化位点意味着它们可参与生物体内多种代谢途径反应，它们可能拥有多种功能。
2.4 龙眼胚性愈伤组织DlMEE70-1a基因编码的蛋白质同源性和进化分析
同源序列比对结果显示，DlMEE70-1a氨基酸序列与原始生物藻类植物的团藻、莱茵衣藻和蕨类植物江南卷柏相似性分别为65.51%、65.05%和72.23%；与裸子植物北美云杉、玉米、水稻和拟南芥相似性分别为80.74%、80.32%、81.38%和81.21%；与同源物种荔枝的同源性更是高达98.60%。该基因与其他物种氨基酸具有高度同源性，说明基因功能在进化中的保守性。
采用Mega5.02近邻相接法NJ分析15个不同物种的MEE70进化树，如图8所示，其中原始生物藻类和蕨类被归为一类，裸子植物北美云杉与被子植物被分开归类，被子植物的单子叶植物和双子叶植物各归为一类。此外，同为无患子科的龙眼与荔枝被归为一类。因此，从该进化树上可以看出，该基因的进化符合经典的物种进化过程。
2.5 龙眼体胚发生过程DlMEE70-1a和DlMEE70-1b的表达模式分析
DlMEE70-1a和DlMEE70-1b实时荧光定量分析结果如图9所示，DlMEE70-1a在体胚发生过程的表达总趋势为先降后升，从胚性愈伤组织（EC）、不完全胚型紧实结构（ICpEC）、球形胚（GE）和心形胚（HE），表达量均逐渐下降，呈平稳下降趋势；从心形胚（HE）到鱼雷形胚（TE）阶段，呈明显上升趋势；从鱼雷形胚（TE）到早期子叶型胚（ECE）阶段，其表达量没有明显变化。DlMEE70-1b在体胚发生过程表达量波动较大，其在EC最高急剧下降，至ICpEC最低，呈急剧下降趋势；ICpEC到GE阶段，表达量呈上升趋势；从GE到HE阶段呈现下降趋势，HE表达量与ICpEC基本一致；从HE到TE阶段，表达量没有明显变化；从TE到ECE阶段，表达量呈现明显上升趋势。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b表达趋势以HE为界，除了DlMEE70-1b的ICpEC到GE这个阶段，都表现出先下降，而后上升的趋势。除了ICpEC和TE，通过DlMEE70-1b与DlMEE70-1a表达量在其他4个时期相对表达量基本一致，且两者在EC相对表达量最高。
3 讨论
3.1 DlMEE70基因可变剪接
可变剪接是用不同方式剪接pre-mRNA产生各种各样的mRNA，在多细胞真核生物中广泛存在。在模式植物拟南芥的多个器官有41%～60%的多外显子基因存在可变剪接体，内含子驻留是拟南芥可变剪接显著特征[26]，其中65%内含子驻留出现部分开放阅读框，在非翻译区或者最后一个内含子，它们不参与NMD无义介导的衰变[27]。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b来自同一条基因组，与DlMEE70-1a基因相比，DlMEE70-1b插入第3个部分内含子，使基因转录提前终止，开放阅读框变短，它不参与NMD无义介导的衰变。DlMEE70-1b在龙眼植株中表达情况，有助于进一步了解可变剪接功能。
3.2 生物信息学推测DlMEE70蛋白可能作用机制
DlMEE70-1a和DlMEE70-1b主要定位于过氧化物酶体和细胞核，也有可能定位于叶绿体、线粒体、内质网和液泡。过氧化物酶体发生或功能的缺陷，会导致种子不能萌发、植株矮小、胚胎败育[28]。DlMEE70或过氧化酶体都与胚胎发育相关，两者之间通过何种途径来调控胚胎发育还有待进一步的研究。DlMEE70-1a和DlMEE70-1b各具有4和1个WD结构域，而拟南芥MEE70具有5个WD结构域，这意味着DlMEE70-1a需要DlMEE70-1b协同互作。龙眼DlMEE70可参与多种细胞器代谢，而拟南芥MEE70主要定位于细胞核和叶绿体， 龙眼DlMEE70应具有更复杂的代谢途径和功能。
3.3 DlMEE70-1a和DlMEE70-1b在龙眼体胚发生过程中的协同互作
MEE70作为母性效应基因之一，在体胚发生过程中的调控起着重要的作用。拟南芥msi1败育胚胎中MEE70基因仅在雌配子体形成过程转录，支撑后期的受精卵和合子胚发育。拟南芥msi1败育胚胎有36%停滞在球形胚前或者球形胚，有50%停滞在心形胚，只有少数心形胚继续分裂增殖而不进行分化，说明MEE70具有调控胚胎细胞的分裂和分化的功能，尤其是细胞的分化[2，9]。储备于卵细胞中MEE70 mRNA及其蛋白，基本上能满足合子胚生长发育到心形胚，心形胚之后必须重新启动MEE70基因转录，才能维持胚胎的生长发育。龙眼DlMEE70-1a与拟南芥MEE70在胚胎发育表达趋势一致，具有典型的母性效应基因特点，是调控龙眼胚胎发育关键基因。
DlMEE70-1b和DlMEE70-1a两者在4个时期相对表达量基本一致，且DlMEE70-1b不完全胚性紧实结构表达量最低与DlMEE70-1a在心形胚最低表达量基本一致，暗示这个剂量DlMEE70基因浓度是龙眼体胚发生过程能忍受最低极限浓度；当DlMEE70-1b和DlMEE70-1a比例浓度不一致，转录机制就会启动转录DlMEE70-1b，使其达到DlMEE70-1a一致的比例浓度，这都暗示DlMEE70-1b协同DlMEE70-1a调控龙眼胚胎发育。与DlMEE70-1a平稳下降不同，DlMEE70-1b从胚性愈伤组织最高点急剧下降到不完全胚性紧实结构阶段最低点，可以推测DlMEE70-1b还具有其他功能。 参考文献
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