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【摘要】 目的 探讨螺内酯对大鼠心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响。方法 选择30只健康SD大鼠，采用结扎冠MI/RI）前降支后再通的方法=10心肌缺血再灌注的动物模型，随机分为3组：假手术组（n=10）、缺血再灌注（MI/RI）组（n=l0）和药物组（n=10）。光镜及电镜观察标本病理形态改变，检测各组再灌注3h后心肌局部凋亡相关因子Bcl-2、Fas的表达，比较各组间差异。结果 与假手术组比较，MI/RI组中Fas含量升高（P<0.01），Bcl-2含量明显减少（P<0.05）；药物组较MURI组Fas含量明显降低（P<0.05），Bcl-2含量明显增加（P 【关键词】 缺血再灌注损伤；螺内酯；细胞凋亡；大鼠
文章编号：1004-7484（2014）-02-0658-02
生理状态下心肌内存在一定量的氧自由基（oxygen free radic，OFR），组织细胞发生缺血缺氧时氧自由基清除功能下降，生成活性增强[1]；组织恢复血液和氧供时，又可产生大量的氧自由基，以各种方式造成细胞的急慢性损伤[2]，使缺血性损伤进一步加重。多年来，医学界一直在探索有效的觖血心肌约再灌注疗法，通过恢复缺血心肌的血液供应来挽救急性缺血的心肌组织，是目前治疗急性心肌缺血及心肌梗死的主要措施：但是再灌注疗法却存在缺血再灌注损伤（MI/RI）等问题。由于心肌组织上存在大量醛固酮产物和盐皮质激素受体，因此本实验运用醛固酮拮抗剂螺内酯提前干预，探讨螺内酯是否具有减轻MI/RI时心肌细胞凋亡程度和改善心功能的作用。
1 资料与方法
1.1 材料与分组
1.1.1 药品和试剂螺内酯（某制药厂），Fas和Bcl-21免疫组化试剂盒（购自某生物有限公司）。
1.1.2 实验动物及分组采用随机平行对照的研究方法，选用清洁级SD大鼠30只（由某大学医学院动物中心提供），雌雄不限，质量200-2509，适应性饲养7d后用于实验。随机分为3组，假手术组（SHAM，n=10）、单纯缺血再灌注组（MI/RI.n=10）和螺内酯干预缺血再灌注组（SPI，凡：10）。SPI组于术前l周开始灌胃喂饲螺内酯[5mg/（kg*d），bid]，所有实验鼠术前禁食，自由饮水，以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。心肌MI/RI模型参照Simpsond的方法加以改进，开胸暴露心脏，于冠脉左前降支中1/2处穿线坏绕，结扎线向外收紧，通过肉眼观察心肌颜色判断结扎是否成功.45min后放松结扎线使冠状动脉再通形成再灌注。其中假手术组丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，所有实验动物冠状动脉再通形成后再灌注3h，后静脉注入硫喷妥钠致死动物，离断大血管，取出心脏用冰生理盐水迅速冲去心脏表面血液，剪除右心室及室间隔，选取MI/RI区标本切成4mm×4咖x6mm数块，浸入4%福尔马林固定液准备行光镜和免疫组f{=检测.另取Imm×lmm×2mm标本放人3%戊二醛固定液放人4℃冰箱中冷藏以备电镜检测。
1.2 检测方法
1.2.1 凋亡相关基因蛋白的检测再灌注3h结束后分离左心室心肌，取缺血区心肌组织，用100g/L甲醛液固定24h.常规脱水，石蜡包埋组织连续切片。以免疫组化SP法观察心肌细胞Fas、Bcl-2的表达情况。HPIAS21000图像分析系统计算4值，作为测量Fas.Bcl-2蛋白表达的半定量参数。
1.2.2 电镜检测取样品组织置入3%戊二醛内预固定.0.1mmo/L磷酸缓冲液洗3遍。10g/L四氧化锇酸后固定，双蒸水冲洗，逐级丙酮酸脱水，环氧树脂包埋.半薄切片，光镜观察定
位，超薄切片，醋酸油、柠檬酸铅双染，H-600透射电镜观察1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以χ±s表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。
2 结 果
2.1 实验动物存活评价共计建立大鼠模型30只，术中及术后死亡3只，假手术组10只全部存活，缺血再灌注组存活8只，死亡2只，药物组存活9只，死亡1只。假手术组大鼠心脏肉眼观形态饱满，呈暗红色；MURI组大鼠心脏肉眼观梗死MURI变薄，形态僵硬，塌陷，呈乳白色；药物组整体观形态与MI/RI组无显著差异，颜色略深呈灰白色。
2.2 Fas和Bcl-2蛋白含量变化（A值）免疫组织化学染色后，Bcl-2和Fas蛋白阳性染色的细胞，其胞浆呈棕黄色。假手术组可见轻度的Bcl-2和Fas蛋白染色弱阳性，MI/RI组与假手术组比较bcl-2表达明显下降，Fas表达上调。药物组与MVRI组比较，螺内酯能明显减低这一现象。
MI/RI组Fas含量（0.26±0.13）明显高于假手术组（0.12±0.04）（P<0.01），药物组Fas含量（0.15土0.03）明显低于MI/RI组（0.25+0.12）（P<0.05）；MI/RI组Bcl-2含量（0.11±0.05）明显
低于假手术组（0.21+0.04）（P<0.01），药物组Bcj-2含量（0.19±0.03）明显高于MI/RI组（0.10±0.05）（P<0.01）。
3 讨 论
心肌缺血再灌注损伤发生的确切机制尚不明确，但研究发现.I/R可能与钙超载和氧自由基所致损伤有关。
缺氧尤其是再灌注期间激活Na+-H+交换，导致细胞内Na+浓度增高，增加了Na+-Ca+交换机会，Ca+集聚于细胞内，Ca+增高超载有可能启动胞凋亡。Na+-H+交换阻断剂HOE642及Ca+拮抗劉可抻剖因钙超载导致的细胞凋亡，从而减轻I/R伤、缩小心肌梗死面积[1]。氧化还原反应是机体最广泛和最重要的反应，在缺血再灌注时可产生大量的活性氧自由基，它们与蛋白质，DNA和脂质等反应引起蛋白质氧化、DNA断裂、胞膜出泡等绸囊胃亡的典型特征变化，一些抗氧化物质及清除自由基的药物可减轻这一反应。 醛固酮能誘导蛋白质合成，促进细胞增殖。研究表明，醛固酮进入细胞后，仅与细胞质受体结合，形成激素一受体复合物，获得进入核内的能力，再与受体结合，诱导蛋白质合成，促进细胞增殖；醛固酮也可以直接增加核Ca2+及蛋白激酶C的含量，核Ca2+的增加能激活蛋白激酶C，蛋白激酶C可以导致核P53磷酸化与醛固酮受体结合，影响心肌细胞凋亡[4-5]。螺内酯在受体水平上阻断醛固酮的生物，阻断醛固酮与P53的结合，抑制P53的激活，阻断了P53对Bax及Bcl-2的调节作用，使Bcl-2下降。
螺内酯抑制I/R时，心肌细胞凋亡的途径可能是通过阻断醛固酮与心肌细胞膜上受体结合，因为二者结合激活位于心肌细胞膜上的磷脂酶C，磷脂酶C使胞浆内Ca2+浓度迅速升高激活蛋白激酶C，蛋白激酶C激活钙调磷酸酶，钙调磷酸酶影响前凋亡蛋白Bax，它能够作用于线粒体使线粒体膜电位降低甚至于跨膜电位消失，同时伴有线粒体膜通透性升高，释放细胞色素C，细胞色素C与凋亡蛋白激活因子及半胱氨酸蛋白酶形成复合物，激活半胱氨酸蛋白酶-3导致细胞凋亡[6]。
本实验中我们观察到大鼠缺血再灌注前给予螺内酯可以使心肌细胞Fas蛋白表达减弱，Bcl-2蛋白表达增强，表明螺内酯能抑制I/R过程中细胞凋亡的发生。通过调节Bcl-2和Fas表达来抑制心肌细胞凋亡，可能是螺内酯保护I/R心肌损伤的重要机制。螺内酯作为一种醛固酮拮抗剂，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用[7]，螺内酯下调细胞凋亡相关蛋白的表达，部分逆转左心室肥厚[6]。
我们研究发现，缺血45min再灌注3h后，螺内酯降低I/R时心肌细胞凋亡程度，从免疫组化结果分析，SPI组心肌细胞中Bax表达比I/R组明显减少，而Bcl-2表达又较I/R组多，细胞凋亡亦较I/R组少。提示螺内酯对UR心的影响有可能是通过抑制激活蛋白激酶C途径抑制心肌细胞凋亡，从而改善急性损伤导致的心功能的下降。这一结果支持Harada等的有关螺内酯对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用和具有抗心肌细胞凋亡作用的报道。
参考文献
[1] Hseu Y C，Huang H W，Wang S Y.et al.Humic acid induces apoptosis in human endothelial cells [J].ToxicolApplPharmacol，2009，182（1）：34-43.
[2] Christakos S，Barletta F，Huening M.et al.Vitamin D target proteins： Function and regulation [J].J Cell Biochem，2010，88（2）：238-244.
[3] Chakrabarti S，Hoqne A N E.Kmmazyn M.A rapid isnhemia-induced apoptosis in isolated rat hearts and its atteuation by the sodium-hydrogen exchange inhibitor HOE642（apriporide）[J].J Mol Cell Cardiol，2013，29：3169.3174.
[4] Nakamura T，Kataoka K，Fukuda M，et al.Critical role Of apoptosis signal-regulating kinase I in aldosterone/salt-induced cardiac inflammation and fibrosis [J].Hypertension，2009，54：544-551.
[5] Lee S H.Yoo T H，Nam B Y，et al.Activation of local aldostetone system within podocytes is involved in apoptosis under diabetic conditions [J].Am J Physiol Renal Physi01，2009，297：F1381-F1390.
[6] Kenneth N S.White R J.Regulation hy c-Myc of ncRNAexpression [J].Current Opinion in Cenetics&Development，2009，19：38-43.
[7] Tomatsurin，Yoshid N，Takagi T，et al.Edaravone，a newly developed radical scavenger，protects against ischemia-reperfusion injury of the small intestine in rats [J].Int J Mol Med，2004，13（l）：105-109.
文章编号：1004-7484（2014）-02-0658-02
生理状态下心肌内存在一定量的氧自由基（oxygen free radic，OFR），组织细胞发生缺血缺氧时氧自由基清除功能下降，生成活性增强[1]；组织恢复血液和氧供时，又可产生大量的氧自由基，以各种方式造成细胞的急慢性损伤[2]，使缺血性损伤进一步加重。多年来，医学界一直在探索有效的觖血心肌约再灌注疗法，通过恢复缺血心肌的血液供应来挽救急性缺血的心肌组织，是目前治疗急性心肌缺血及心肌梗死的主要措施：但是再灌注疗法却存在缺血再灌注损伤（MI/RI）等问题。由于心肌组织上存在大量醛固酮产物和盐皮质激素受体，因此本实验运用醛固酮拮抗剂螺内酯提前干预，探讨螺内酯是否具有减轻MI/RI时心肌细胞凋亡程度和改善心功能的作用。
1 资料与方法
1.1 材料与分组
1.1.1 药品和试剂螺内酯（某制药厂），Fas和Bcl-21免疫组化试剂盒（购自某生物有限公司）。
1.1.2 实验动物及分组采用随机平行对照的研究方法，选用清洁级SD大鼠30只（由某大学医学院动物中心提供），雌雄不限，质量200-2509，适应性饲养7d后用于实验。随机分为3组，假手术组（SHAM，n=10）、单纯缺血再灌注组（MI/RI.n=10）和螺内酯干预缺血再灌注组（SPI，凡：10）。SPI组于术前l周开始灌胃喂饲螺内酯[5mg/（kg*d），bid]，所有实验鼠术前禁食，自由饮水，以戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。心肌MI/RI模型参照Simpsond的方法加以改进，开胸暴露心脏，于冠脉左前降支中1/2处穿线坏绕，结扎线向外收紧，通过肉眼观察心肌颜色判断结扎是否成功.45min后放松结扎线使冠状动脉再通形成再灌注。其中假手术组丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，所有实验动物冠状动脉再通形成后再灌注3h，后静脉注入硫喷妥钠致死动物，离断大血管，取出心脏用冰生理盐水迅速冲去心脏表面血液，剪除右心室及室间隔，选取MI/RI区标本切成4mm×4咖x6mm数块，浸入4%福尔马林固定液准备行光镜和免疫组f{=检测.另取Imm×lmm×2mm标本放人3%戊二醛固定液放人4℃冰箱中冷藏以备电镜检测。
1.2 检测方法
1.2.1 凋亡相关基因蛋白的检测再灌注3h结束后分离左心室心肌，取缺血区心肌组织，用100g/L甲醛液固定24h.常规脱水，石蜡包埋组织连续切片。以免疫组化SP法观察心肌细胞Fas、Bcl-2的表达情况。HPIAS21000图像分析系统计算4值，作为测量Fas.Bcl-2蛋白表达的半定量参数。
1.2.2 电镜检测取样品组织置入3%戊二醛内预固定.0.1mmo/L磷酸缓冲液洗3遍。10g/L四氧化锇酸后固定，双蒸水冲洗，逐级丙酮酸脱水，环氧树脂包埋.半薄切片，光镜观察定
位，超薄切片，醋酸油、柠檬酸铅双染，H-600透射电镜观察1.3统计学处理采用SPSS13.0统计软件处理，计量资料以χ±s表示，多组计量资料比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。
2 结 果
2.1 实验动物存活评价共计建立大鼠模型30只，术中及术后死亡3只，假手术组10只全部存活，缺血再灌注组存活8只，死亡2只，药物组存活9只，死亡1只。假手术组大鼠心脏肉眼观形态饱满，呈暗红色；MURI组大鼠心脏肉眼观梗死MURI变薄，形态僵硬，塌陷，呈乳白色；药物组整体观形态与MI/RI组无显著差异，颜色略深呈灰白色。
2.2 Fas和Bcl-2蛋白含量变化（A值）免疫组织化学染色后，Bcl-2和Fas蛋白阳性染色的细胞，其胞浆呈棕黄色。假手术组可见轻度的Bcl-2和Fas蛋白染色弱阳性，MI/RI组与假手术组比较bcl-2表达明显下降，Fas表达上调。药物组与MVRI组比较，螺内酯能明显减低这一现象。
MI/RI组Fas含量（0.26±0.13）明显高于假手术组（0.12±0.04）（P<0.01），药物组Fas含量（0.15土0.03）明显低于MI/RI组（0.25+0.12）（P<0.05）；MI/RI组Bcl-2含量（0.11±0.05）明显
低于假手术组（0.21+0.04）（P<0.01），药物组Bcj-2含量（0.19±0.03）明显高于MI/RI组（0.10±0.05）（P<0.01）。
3 讨 论
心肌缺血再灌注损伤发生的确切机制尚不明确，但研究发现.I/R可能与钙超载和氧自由基所致损伤有关。
缺氧尤其是再灌注期间激活Na+-H+交换，导致细胞内Na+浓度增高，增加了Na+-Ca+交换机会，Ca+集聚于细胞内，Ca+增高超载有可能启动胞凋亡。Na+-H+交换阻断剂HOE642及Ca+拮抗劉可抻剖因钙超载导致的细胞凋亡，从而减轻I/R伤、缩小心肌梗死面积[1]。氧化还原反应是机体最广泛和最重要的反应，在缺血再灌注时可产生大量的活性氧自由基，它们与蛋白质，DNA和脂质等反应引起蛋白质氧化、DNA断裂、胞膜出泡等绸囊胃亡的典型特征变化，一些抗氧化物质及清除自由基的药物可减轻这一反应。 醛固酮能誘导蛋白质合成，促进细胞增殖。研究表明，醛固酮进入细胞后，仅与细胞质受体结合，形成激素一受体复合物，获得进入核内的能力，再与受体结合，诱导蛋白质合成，促进细胞增殖；醛固酮也可以直接增加核Ca2+及蛋白激酶C的含量，核Ca2+的增加能激活蛋白激酶C，蛋白激酶C可以导致核P53磷酸化与醛固酮受体结合，影响心肌细胞凋亡[4-5]。螺内酯在受体水平上阻断醛固酮的生物，阻断醛固酮与P53的结合，抑制P53的激活，阻断了P53对Bax及Bcl-2的调节作用，使Bcl-2下降。
螺内酯抑制I/R时，心肌细胞凋亡的途径可能是通过阻断醛固酮与心肌细胞膜上受体结合，因为二者结合激活位于心肌细胞膜上的磷脂酶C，磷脂酶C使胞浆内Ca2+浓度迅速升高激活蛋白激酶C，蛋白激酶C激活钙调磷酸酶，钙调磷酸酶影响前凋亡蛋白Bax，它能够作用于线粒体使线粒体膜电位降低甚至于跨膜电位消失，同时伴有线粒体膜通透性升高，释放细胞色素C，细胞色素C与凋亡蛋白激活因子及半胱氨酸蛋白酶形成复合物，激活半胱氨酸蛋白酶-3导致细胞凋亡[6]。
本实验中我们观察到大鼠缺血再灌注前给予螺内酯可以使心肌细胞Fas蛋白表达减弱，Bcl-2蛋白表达增强，表明螺内酯能抑制I/R过程中细胞凋亡的发生。通过调节Bcl-2和Fas表达来抑制心肌细胞凋亡，可能是螺内酯保护I/R心肌损伤的重要机制。螺内酯作为一种醛固酮拮抗剂，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用[7]，螺内酯下调细胞凋亡相关蛋白的表达，部分逆转左心室肥厚[6]。
我们研究发现，缺血45min再灌注3h后，螺内酯降低I/R时心肌细胞凋亡程度，从免疫组化结果分析，SPI组心肌细胞中Bax表达比I/R组明显减少，而Bcl-2表达又较I/R组多，细胞凋亡亦较I/R组少。提示螺内酯对UR心的影响有可能是通过抑制激活蛋白激酶C途径抑制心肌细胞凋亡，从而改善急性损伤导致的心功能的下降。这一结果支持Harada等的有关螺内酯对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用和具有抗心肌细胞凋亡作用的报道。
参考文献
[1] Hseu Y C，Huang H W，Wang S Y.et al.Humic acid induces apoptosis in human endothelial cells [J].ToxicolApplPharmacol，2009，182（1）：34-43.
[2] Christakos S，Barletta F，Huening M.et al.Vitamin D target proteins： Function and regulation [J].J Cell Biochem，2010，88（2）：238-244.
[3] Chakrabarti S，Hoqne A N E.Kmmazyn M.A rapid isnhemia-induced apoptosis in isolated rat hearts and its atteuation by the sodium-hydrogen exchange inhibitor HOE642（apriporide）[J].J Mol Cell Cardiol，2013，29：3169.3174.
[4] Nakamura T，Kataoka K，Fukuda M，et al.Critical role Of apoptosis signal-regulating kinase I in aldosterone/salt-induced cardiac inflammation and fibrosis [J].Hypertension，2009，54：544-551.
[5] Lee S H.Yoo T H，Nam B Y，et al.Activation of local aldostetone system within podocytes is involved in apoptosis under diabetic conditions [J].Am J Physiol Renal Physi01，2009，297：F1381-F1390.
[6] Kenneth N S.White R J.Regulation hy c-Myc of ncRNAexpression [J].Current Opinion in Cenetics&Development，2009，19：38-43.
[7] Tomatsurin，Yoshid N，Takagi T，et al.Edaravone，a newly developed radical scavenger，protects against ischemia-reperfusion injury of the small intestine in rats [J].Int J Mol Med，2004，13（l）：105-109.