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摘要：[目的]明确广西黄牛是否存在牛乳头状瘤病毒（Bovine papillomavirus，BPV）感染，为今后制定科学的防控措施提供参考依据。[方法]从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的皮肤上采集瘤状物病料，在临床观察和组织病理学观察的基础上，采用PCR对其进行鉴定和基因型分型，再根据鉴型结果设计5对特异性引物对BPV基因组进行扩增及测序分析。[结果]黄牛皮肤瘤状物的病理组织切片观察发现，表皮与真皮增生，表皮细胞角质化和空泡化，细胞呈梭形或星形。从瘤状物中分离获得1株毒株，其与BPV-1型的同源性达99.0%，命名为BPV-GX-LA150909。BPV-GX-LA150909毒株基因组全长7946 bp，GenBank登录号为MF435918，包含早期基因区（E区）、晚期基因区（L区）和非编码区（NCR区）3个区域。BPV-GX-LA150909毒株无论是其基因组还是L1基因，均与BPV-1型的同源性最高，尤其与贵州株BPV-1 GZLZ的同源性分别为99.9%和99.7%，且在系统发育进化树上也是与BPV-1 GZLZ的遗传距离较近。BPV-GX-LA150909毒株的Ll蛋白具有潜在的B细胞抗原表位，含有17个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点。[结论]广西黄牛群中已存在BPV-1型感染，且与国内外BPV-1型的同源性较高，说明BPV跨地区传播是不可忽视的问题。
关键词：牛乳头状瘤病毒（BPV）；鉴定；基因组；L1基因；基因型；广西
中图分类号：S858.23 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0563-09
0引言
[研究意义]牛乳头状瘤病毒（Bovine papillo-maims，BPV）属于牛乳头状瘤病毒科成员，能以一种特殊方式感染动物的黏膜及皮肤的上皮细胞，引起良性和恶性相关细胞的增殖（Ataseven et a1.，2016）。至今，已有黄牛、水牛、野牛、长颈鹿、斑马、羚羊、马、驴等多种脊椎动物感染BPV的報道（Roias-Anaya et a1.，2016）。黄牛是我国主要的家畜品种之一，具有役用、食用及工艺等价值。BPV能感染各年龄段的黄牛，严重时瘤体会转变成恶性，甚至导致死亡，给黄牛养殖业带来巨大经济损失。因此，加强BPV的相关研究对保障黄牛养殖业健康持续发展具有重要意义。[前人研究进展]BPV为圆形颗粒、双股DNA病毒，基因组全长7.3-8.0 kb，由3个区域组成，分别为非编码区（NCR区）、早期基因区（E区）和晚期基因区（L区）（Freltas et a1.，2011）。其中，NCR区长500-1000 bp，含有病毒复制和转录的相关调节信号；E区编码6-8种非结构蛋白（E1-E8）；L区负责编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。L1蛋白可诱导机体产生中和抗体，激发保护性免疫，是进行预防免疫的主要靶抗原，具有B细胞特异性的抗原表位。此外，L1蛋白作为一种糖蛋白，约含有500个氨基酸残基，且富含糖基化的相关位点（张海等，2016）。BPV自1929年首次报道以来，在巴西（Daudt et a1.，2016）、墨西哥（Roias-Anaya et a1.，2016）、伊拉克（Hamad et a1.，2016）、摩洛哥（Regnard et a1.，2017）等国家均有报道。BPV拥有14个基因型，分属于4个属，分别为Deltapapillomavirus属（BPV-1、BPV-2、BPV-13和BPV-14）、Xipapillomavirus属（BPV-3、BPV-4、BPV-6、BPV-9、BPV-10、BPV-11和BPV-12）、Epsilonpapillomavirus属（BPV-5和BPV-8）和Dyoxi-papillomavirus属（BPV-7）（Roperto et a1.，2016）。我国于1973年首次发现BPV，此后，贺志昊等（2013）对我国BPV新疆流行株进行全基因序列测定分析，确定为BPV-2型；梁辰等（2013）对河南某奶牛场犊牛的皮肤瘤样物进行检测，结果发现犊牛的皮肤瘤是由BPV-1型和BPV-2型引起；Pang等（2014）报道海南黄牛中存在BPV-13型感染，并对该病毒进行全基因扩增测序分析；张海等（2016，2017）先后报道了BPV贵州毒株BPV-2型和BPV-1型，并对BPV-2型L1基因编码蛋白的B细胞优势抗原表位进行分析。[本研究切入点]目前，在我国新疆、海南、贵州和河南等地均有BPV感染的相关报道，且不同地区的BPV基因型不一样。虽然广西至今未见家畜感染BPV的研究报道，但是否表明不存在BPV感染尚需进一步调查研究。[拟解决的关键问题]鉴于在广西地区开展黄牛BPV研究的必要性，2015年9月从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的皮肤上采集瘤状物病料，根据已发表的BPV基因组序列设计特异性引物对其基因组进行扩增及测序分析，旨在明确广西黄牛是否存在BPV感染，为今后制定科学的防控措施提供参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
2015年9月从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的头颈、背部和足部皮肤采集颗粒状、菜花样的瘤状物病料，其中一部分病料用于病原诊断，另一部分病料以4%多聚甲醛溶液进行固定。通用型基因组DNA抽提试剂盒、2×Es Taq Master Mix（Dye）、DL2000 DNA Marker、DNA胶回收试剂盒等购自北京康为世纪生物科技有限公司；PCR仪购自美国Life公司；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2引物设计与合成
先采用Hatama等（2008）设计的引物FAP59-F/FAP64-R进行PCRY.f增，鉴定BPV的基因型；然后根据GenBank中已发表的BPV基因组序列（登录号x02346），利用Oligo 7.0设计5对特异性引物，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，具体引物信息见表1。 1.3组织病理学观察
取瘤状物病料用4%多聚甲醛溶液进行固定，按常规方法进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片及HE染色，光学显微镜下观察其组织病理学变化。
1.4病毒基因组PCR扩增
参照通用型基因组DNA提取试剂盒说明抽提瘤状物病料的DNA，以此为模板，应用设计的5对特异引物进行PCR扩增。PCR反应体系25.0μL，包括2xES Taq Master Mix（Dye）12.5μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH20 8.5 μL。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃40 s，54℃50 s，72℃90 s，进行35个循环；最后72℃延伸10 min。
1.5病毒基因组测序分析
按照DNA胶回收试剂盒说明纯化回收PCR产物，与pUC-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR鉴定，取3个阳性菌液送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。然后采用MegAlign进行序列同源性比对分析，并以MEGA 7.0进行系统发育进化树分析；应用Lasergene 7.0中的Protean进行B细胞抗原表位预测，同时采用NetOGlvc 4.0 Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和NetNGlyc 1.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分别进行O-糖基化位点和N-糖基化位点分析。
2结果与分析
2.1黄牛皮肤瘤状物病理组织切片的观察结果
黄牛的头颈、背部和足部皮肤有颗粒状、菜花样的瘤状物（图1-a）。对黄牛皮肤瘤状物进行病理组织切片，经HE染色后镜检发现，表皮细胞呈过度角质化（图1-b）；表皮与真皮增生，部分颗粒细胞呈空泡化现象（图1-c）；细胞呈梭形或星型，可观察到早期细胞核分裂象（图1-d）。
2.2病毒PCR鉴定结果
以FAP59-F/FAP64-R为引物、瘤状物病料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果获得与预期结果相符的目的条带（图2）。对扩增获得的目的条带进行回收测序，测序结果在NCBI上进行同源性比对分析，结果表明，本研究分离获得的毒株与BPV-1型的同源性达99.0%，由此推测该分离毒株为BPV-1型，并命名为BPV-GX-LA150909。
2.3病毒基因组PCR扩增结果
以设计的5对特异性引物对BPV-GX-LA150909毒株进行全基因扩增，结果获得大小分别为1805、1902、1944、1946和1104 bp的5条单一条带（图3），而所有的阴性对照均未扩增出任何条带，与预期结果符合，说明设计的5对引物特异性良好。
2.4病毒基因组序列分析结果
应用Lasergene 7.0中的SeqMan对BPV-GX-LA150909毒株的5段基因进行拼接，得到其基因组全长7946 bp，GC含量为45.32%，将序列提交至Gen-Bank，登录号为MF435918。该病毒基因组包含E区、L区和NCR区3个区域（图4_b）。8个开放阅读框（0RF）分别编码6个早期蛋白（E6、E7、E1、E2、E4和E5）和2个晚期蛋白（L2和L1），详见表2。其中，E6、E7、E1和E2基因有部分重叠，E4基因完全包含在E2基因中，E4和E5基因没有重叠。E2基因在481～491nt上含有1个E2结合位点的共有序列（ACCX6GGT）（张婉琪等，2015）；E6蛋白在18～22 aa位置上含有成视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）结合位点（LXCxE），而E7蛋白在82～118 aa位置上含有典型的锌指结构域（CX2CX29CX2C）（Munday et a1.，2015）。
BPV-GX—LAl50909毒株在L1和E6之间存在一个长934 bp的NcR区（图4-a和图4-c），主要起调节病毒转录的作用（Munday et a1.，2015）。该基因组在59～66 nt（TATAAAA）位置上和7109～7115 nt（TATA-AAT）位置上存在TATA盒子（图4中的红色虚线方框）；在7156～7161 nt（AATAAA）的位置上有E区和L区mRNA的多腺苷酸化信号p10y（A）（图4中的绿色实线方框）；在7627～7638 nt的位置上有回文结构（TcGGTGCAccGA），即NcR区增强子序列（图4中的黄色椭圆部分）。BPV-GX-LA150909毒株的核因子结合位点NF-1位于基因组7326～7331 nt（TTGGCA）的位置上（图4中的蓝色波浪线）。此外，NcR区含有10个E2结合位点的共有序列（ACCx。GGT）（图4中的紫色划线部分），分别位于7203～7214 nt（ACCACACCCGGT）、7365～7376 nt（ACCGGCGGCGGT）、7408～7419 nt（ACCTATCCCGGT）、75 10～7521nt（ACCAGAACTGGT）、7591～7662 nt（ACCAGTAATGGT）、7620～763 1 nt（ACCGCCATCGGT）、7634-7645 nt（ACCGATATAGGT）、7760～7771 nt（ACCGTTGCCGGT）、778 1～7792 nt（ACCGTCTTCGGT）和7896～7907 nt（ACCGAAACCGGT）。
2.5病毒基因组及L1基因核苷酸序列的同源性比对分析结果
对BPV-GX-LA150909毒株与14种BPV基因型16株参考株（表3）的基因组进行核苷酸序列同源性比对分析，结果发现其同源性在41.8%～99.9%（图5），其中与贵州株BPV-1 GZLz（MF045489）型的同源性最高（99.9%），与BPV-1（Nc001522）和新疆株BPV-1 SY-12（KX907623）的同源性也超过99.0%，而与BPV-7（Nc007612）的同源性最低（41.8%）。同时，对BPV-GX—LA150909毒株与16株参考株的L1基因进行核苷酸序列同源性比对分析，结果发现其同源性在52.4%～99.7%（图6），与BPV-1 GzLZ（MF045489）、BPV-1（NC001522）和BPV-1 SY-12（KX907623）的同源性均在99.0%以上，進一步佐证BPV-GX-LA150909毒株属于BPV-1型。 2.6基于病毒基因组及L1基因核苷酸序列的系统发育进化树分析结果
基于BPV基因组核苷酸序列，采用MEGA 7.0对BPV-GX-LA150909毒株和16株参考株进行系统发育进化树分析，结果显示1 7株BPV分离株可分成4个属（图7）。其中，BPV-GX-LA150909毒株与BPV-1型分离株先聚在同一分支上，再与BPV-2（KC878306）、BPV-13（JQ798171）和BPV-14（KR868228）聚在Del-tapapillomavirus属分支上。基于L1基因核苷酸序列构建的系统发育进化树也得到相同结果（图8）。
2.7L1蛋白B细胞抗原表位预测及糖基化位点预测结果
采用Protean对BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白进行B抗原表位预测，结果表明，α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲区域出现的概率较高，而β-转角出现的概率较低；该蛋白的亲水性良好、柔韧性分布均匀、抗原性和表面可极性高（图9）。BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白具有潜在的B细胞抗原表位，与张海等（2016）的研究结果一致。此外，L1蛋白的O-糖基化位点和N-糖基化位点预测结果表明，BPV-GX-LA1 50909毒株L1蛋白含有17个N-糖基化位点（15T、133T、134T、136T、137T、166T、167T、173T、268T、421S、428S、474S、475T、482S、485T、486S和487S）和1个N-糖基化位点（338NLT），与3株BPV-1型参考株的预测结果一致，但与其他13株参考毒株存在明显差异。
3讨论
BPV可诱发纤维乳头状瘤和皮肤乳头状瘤及黏膜损伤，通常受环境的协同影响可演变为恶性病变。BPV的基因型众多，不同基因型侵害的部位和临床病变也会存在一定差异，如BPV-1型和BPV-2型不仅可引起纤维乳头状瘤，还能引起膀胱尿路上臂的非增殖性感染（Resendes et a1.，2011）。此外，在牛皮肤肿瘤病变和膀胱肿瘤能检测到BPV一14型（Ropertoet a1.，2016）。Xipapillomavirus属具有严格宿主的转移性，BPV-4型可引起乳头瘤病和上消化道癌症（Zhu et a1.，2012）；BPV-9型和BPV-10型可引起乳房的鳞状上皮乳头瘤，而皮肤乳头瘤的发生可能还与BPV-3型有关（Batista et a1.，2013）；BPV-5型和BPV-8型可引起纤维乳头状瘤和真皮乳头状瘤（Tomitaet a1.，2007），但至今未见BPV-7型具有致病性的报道。本研究结果表明，从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛皮肤瘤状物中分离获得的BPV-GX-LA150909毒株无论是基因组还是L1基因，均与BPV-1型的同源性最高，尤其与BPV一1 GZLZ的同源性分别为99.9%和99.7%，且在系统发育进化树上也是与BPV-1GZLZ的遗传距离较近，可能是该分离毒株与BPV-1GZLZ具有相同的来源。这与近年广西从区外大量引进牛种有关，随着牛市交易的频繁，给BPV等病源的传播创造了条件，从而给广西养牛行业的持续健康发展带来巨大挑战。
L1基因较保守，具有重要的生物学功能，常作为乳头瘤病毒基因型的鉴定指标（史巧芸等，2015）。L1基因编码的衣壳蛋白暴露在病毒粒子表面，可能与病毒感染及免疫有关（Doorbar，2005）。此外，L1基因能自我组装成病毒样颗粒，但无致瘤活性，是研制疫苗的候选基因。因此，越来越多的学者开始致力于L1基因研究。贺志昊等（2014）、赵天靖等（2015）分别对BPV-2型和BPV-13型的L1基因进行克隆及原核表达，均证明L1蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。本研究采用Protean对分离毒株的L1蛋白进行B抗原表位预测，结果表明，BPV-GX-LA1 50909毒株的L1蛋白具有潜在的B细胞抗原表位，但是否能引起机体免疫反应、产生特异性抗体，还需进一步研究验证。糖基化是在酶的控制下，将糖转移至蛋白质并与蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键的过程。O-糖基化是将糖链转移到多肽链丝氨酸（ser）或苏氨酸（Thr）的羟基氧原子上（连高焱和俞飚，2012），O-糖链的功能是维持与连接蛋白质的空间构象，起保护作用（刘可人等，2006）；而N-糖基化位点与O-糖基化位点不同，其保守序列是N-X-S/T，其中X是除脯氨酸（P）以外的其他氨基酸，N是糖基化位点。病毒表面蛋白发生的N-糖基化在病毒感染和扩散等方面发挥着重要作用。本研究发现BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白含有17个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点，可能与蛋白正确折叠及增加蛋白的稳定性有关。蛋白糖基化是连接蛋白质和糖类的桥梁，因此下一步需加强对BPV L1蛋白糖基化的研究，为阐明其发病机制及早期诊断治疗提供科学依据。
4结论
广西黄牛群中已存在BPV-1型感染，且与国内外BPV-1型的同源性较高，说明BPV跨地區传播是不可忽视的问题。
（责任编辑 兰宗宝）
关键词：牛乳头状瘤病毒（BPV）；鉴定；基因组；L1基因；基因型；广西
中图分类号：S858.23 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）03-0563-09
0引言
[研究意义]牛乳头状瘤病毒（Bovine papillo-maims，BPV）属于牛乳头状瘤病毒科成员，能以一种特殊方式感染动物的黏膜及皮肤的上皮细胞，引起良性和恶性相关细胞的增殖（Ataseven et a1.，2016）。至今，已有黄牛、水牛、野牛、长颈鹿、斑马、羚羊、马、驴等多种脊椎动物感染BPV的報道（Roias-Anaya et a1.，2016）。黄牛是我国主要的家畜品种之一，具有役用、食用及工艺等价值。BPV能感染各年龄段的黄牛，严重时瘤体会转变成恶性，甚至导致死亡，给黄牛养殖业带来巨大经济损失。因此，加强BPV的相关研究对保障黄牛养殖业健康持续发展具有重要意义。[前人研究进展]BPV为圆形颗粒、双股DNA病毒，基因组全长7.3-8.0 kb，由3个区域组成，分别为非编码区（NCR区）、早期基因区（E区）和晚期基因区（L区）（Freltas et a1.，2011）。其中，NCR区长500-1000 bp，含有病毒复制和转录的相关调节信号；E区编码6-8种非结构蛋白（E1-E8）；L区负责编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2。L1蛋白可诱导机体产生中和抗体，激发保护性免疫，是进行预防免疫的主要靶抗原，具有B细胞特异性的抗原表位。此外，L1蛋白作为一种糖蛋白，约含有500个氨基酸残基，且富含糖基化的相关位点（张海等，2016）。BPV自1929年首次报道以来，在巴西（Daudt et a1.，2016）、墨西哥（Roias-Anaya et a1.，2016）、伊拉克（Hamad et a1.，2016）、摩洛哥（Regnard et a1.，2017）等国家均有报道。BPV拥有14个基因型，分属于4个属，分别为Deltapapillomavirus属（BPV-1、BPV-2、BPV-13和BPV-14）、Xipapillomavirus属（BPV-3、BPV-4、BPV-6、BPV-9、BPV-10、BPV-11和BPV-12）、Epsilonpapillomavirus属（BPV-5和BPV-8）和Dyoxi-papillomavirus属（BPV-7）（Roperto et a1.，2016）。我国于1973年首次发现BPV，此后，贺志昊等（2013）对我国BPV新疆流行株进行全基因序列测定分析，确定为BPV-2型；梁辰等（2013）对河南某奶牛场犊牛的皮肤瘤样物进行检测，结果发现犊牛的皮肤瘤是由BPV-1型和BPV-2型引起；Pang等（2014）报道海南黄牛中存在BPV-13型感染，并对该病毒进行全基因扩增测序分析；张海等（2016，2017）先后报道了BPV贵州毒株BPV-2型和BPV-1型，并对BPV-2型L1基因编码蛋白的B细胞优势抗原表位进行分析。[本研究切入点]目前，在我国新疆、海南、贵州和河南等地均有BPV感染的相关报道，且不同地区的BPV基因型不一样。虽然广西至今未见家畜感染BPV的研究报道，但是否表明不存在BPV感染尚需进一步调查研究。[拟解决的关键问题]鉴于在广西地区开展黄牛BPV研究的必要性，2015年9月从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的皮肤上采集瘤状物病料，根据已发表的BPV基因组序列设计特异性引物对其基因组进行扩增及测序分析，旨在明确广西黄牛是否存在BPV感染，为今后制定科学的防控措施提供参考依据。
1材料与方法
1.1试验材料
2015年9月从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛的头颈、背部和足部皮肤采集颗粒状、菜花样的瘤状物病料，其中一部分病料用于病原诊断，另一部分病料以4%多聚甲醛溶液进行固定。通用型基因组DNA抽提试剂盒、2×Es Taq Master Mix（Dye）、DL2000 DNA Marker、DNA胶回收试剂盒等购自北京康为世纪生物科技有限公司；PCR仪购自美国Life公司；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。
1.2引物设计与合成
先采用Hatama等（2008）设计的引物FAP59-F/FAP64-R进行PCRY.f增，鉴定BPV的基因型；然后根据GenBank中已发表的BPV基因组序列（登录号x02346），利用Oligo 7.0设计5对特异性引物，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成，具体引物信息见表1。 1.3组织病理学观察
取瘤状物病料用4%多聚甲醛溶液进行固定，按常规方法进行脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片及HE染色，光学显微镜下观察其组织病理学变化。
1.4病毒基因组PCR扩增
参照通用型基因组DNA提取试剂盒说明抽提瘤状物病料的DNA，以此为模板，应用设计的5对特异引物进行PCR扩增。PCR反应体系25.0μL，包括2xES Taq Master Mix（Dye）12.5μL，上、下游引物各1.0μL，DNA模板2.0μL，ddH20 8.5 μL。扩增程序：95℃预变性5 min；95℃40 s，54℃50 s，72℃90 s，进行35个循环；最后72℃延伸10 min。
1.5病毒基因组测序分析
按照DNA胶回收试剂盒说明纯化回收PCR产物，与pUC-T载体连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR鉴定，取3个阳性菌液送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。然后采用MegAlign进行序列同源性比对分析，并以MEGA 7.0进行系统发育进化树分析；应用Lasergene 7.0中的Protean进行B细胞抗原表位预测，同时采用NetOGlvc 4.0 Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和NetNGlyc 1.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）分别进行O-糖基化位点和N-糖基化位点分析。
2结果与分析
2.1黄牛皮肤瘤状物病理组织切片的观察结果
黄牛的头颈、背部和足部皮肤有颗粒状、菜花样的瘤状物（图1-a）。对黄牛皮肤瘤状物进行病理组织切片，经HE染色后镜检发现，表皮细胞呈过度角质化（图1-b）；表皮与真皮增生，部分颗粒细胞呈空泡化现象（图1-c）；细胞呈梭形或星型，可观察到早期细胞核分裂象（图1-d）。
2.2病毒PCR鉴定结果
以FAP59-F/FAP64-R为引物、瘤状物病料的基因组DNA为模板进行PCR扩增，结果获得与预期结果相符的目的条带（图2）。对扩增获得的目的条带进行回收测序，测序结果在NCBI上进行同源性比对分析，结果表明，本研究分离获得的毒株与BPV-1型的同源性达99.0%，由此推测该分离毒株为BPV-1型，并命名为BPV-GX-LA150909。
2.3病毒基因组PCR扩增结果
以设计的5对特异性引物对BPV-GX-LA150909毒株进行全基因扩增，结果获得大小分别为1805、1902、1944、1946和1104 bp的5条单一条带（图3），而所有的阴性对照均未扩增出任何条带，与预期结果符合，说明设计的5对引物特异性良好。
2.4病毒基因组序列分析结果
应用Lasergene 7.0中的SeqMan对BPV-GX-LA150909毒株的5段基因进行拼接，得到其基因组全长7946 bp，GC含量为45.32%，将序列提交至Gen-Bank，登录号为MF435918。该病毒基因组包含E区、L区和NCR区3个区域（图4_b）。8个开放阅读框（0RF）分别编码6个早期蛋白（E6、E7、E1、E2、E4和E5）和2个晚期蛋白（L2和L1），详见表2。其中，E6、E7、E1和E2基因有部分重叠，E4基因完全包含在E2基因中，E4和E5基因没有重叠。E2基因在481～491nt上含有1个E2结合位点的共有序列（ACCX6GGT）（张婉琪等，2015）；E6蛋白在18～22 aa位置上含有成视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）结合位点（LXCxE），而E7蛋白在82～118 aa位置上含有典型的锌指结构域（CX2CX29CX2C）（Munday et a1.，2015）。
BPV-GX—LAl50909毒株在L1和E6之间存在一个长934 bp的NcR区（图4-a和图4-c），主要起调节病毒转录的作用（Munday et a1.，2015）。该基因组在59～66 nt（TATAAAA）位置上和7109～7115 nt（TATA-AAT）位置上存在TATA盒子（图4中的红色虚线方框）；在7156～7161 nt（AATAAA）的位置上有E区和L区mRNA的多腺苷酸化信号p10y（A）（图4中的绿色实线方框）；在7627～7638 nt的位置上有回文结构（TcGGTGCAccGA），即NcR区增强子序列（图4中的黄色椭圆部分）。BPV-GX-LA150909毒株的核因子结合位点NF-1位于基因组7326～7331 nt（TTGGCA）的位置上（图4中的蓝色波浪线）。此外，NcR区含有10个E2结合位点的共有序列（ACCx。GGT）（图4中的紫色划线部分），分别位于7203～7214 nt（ACCACACCCGGT）、7365～7376 nt（ACCGGCGGCGGT）、7408～7419 nt（ACCTATCCCGGT）、75 10～7521nt（ACCAGAACTGGT）、7591～7662 nt（ACCAGTAATGGT）、7620～763 1 nt（ACCGCCATCGGT）、7634-7645 nt（ACCGATATAGGT）、7760～7771 nt（ACCGTTGCCGGT）、778 1～7792 nt（ACCGTCTTCGGT）和7896～7907 nt（ACCGAAACCGGT）。
2.5病毒基因组及L1基因核苷酸序列的同源性比对分析结果
对BPV-GX-LA150909毒株与14种BPV基因型16株参考株（表3）的基因组进行核苷酸序列同源性比对分析，结果发现其同源性在41.8%～99.9%（图5），其中与贵州株BPV-1 GZLz（MF045489）型的同源性最高（99.9%），与BPV-1（Nc001522）和新疆株BPV-1 SY-12（KX907623）的同源性也超过99.0%，而与BPV-7（Nc007612）的同源性最低（41.8%）。同时，对BPV-GX—LA150909毒株与16株参考株的L1基因进行核苷酸序列同源性比对分析，结果发现其同源性在52.4%～99.7%（图6），与BPV-1 GzLZ（MF045489）、BPV-1（NC001522）和BPV-1 SY-12（KX907623）的同源性均在99.0%以上，進一步佐证BPV-GX-LA150909毒株属于BPV-1型。 2.6基于病毒基因组及L1基因核苷酸序列的系统发育进化树分析结果
基于BPV基因组核苷酸序列，采用MEGA 7.0对BPV-GX-LA150909毒株和16株参考株进行系统发育进化树分析，结果显示1 7株BPV分离株可分成4个属（图7）。其中，BPV-GX-LA150909毒株与BPV-1型分离株先聚在同一分支上，再与BPV-2（KC878306）、BPV-13（JQ798171）和BPV-14（KR868228）聚在Del-tapapillomavirus属分支上。基于L1基因核苷酸序列构建的系统发育进化树也得到相同结果（图8）。
2.7L1蛋白B细胞抗原表位预测及糖基化位点预测结果
采用Protean对BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白进行B抗原表位预测，结果表明，α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲区域出现的概率较高，而β-转角出现的概率较低；该蛋白的亲水性良好、柔韧性分布均匀、抗原性和表面可极性高（图9）。BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白具有潜在的B细胞抗原表位，与张海等（2016）的研究结果一致。此外，L1蛋白的O-糖基化位点和N-糖基化位点预测结果表明，BPV-GX-LA1 50909毒株L1蛋白含有17个N-糖基化位点（15T、133T、134T、136T、137T、166T、167T、173T、268T、421S、428S、474S、475T、482S、485T、486S和487S）和1个N-糖基化位点（338NLT），与3株BPV-1型参考株的预测结果一致，但与其他13株参考毒株存在明显差异。
3讨论
BPV可诱发纤维乳头状瘤和皮肤乳头状瘤及黏膜损伤，通常受环境的协同影响可演变为恶性病变。BPV的基因型众多，不同基因型侵害的部位和临床病变也会存在一定差异，如BPV-1型和BPV-2型不仅可引起纤维乳头状瘤，还能引起膀胱尿路上臂的非增殖性感染（Resendes et a1.，2011）。此外，在牛皮肤肿瘤病变和膀胱肿瘤能检测到BPV一14型（Ropertoet a1.，2016）。Xipapillomavirus属具有严格宿主的转移性，BPV-4型可引起乳头瘤病和上消化道癌症（Zhu et a1.，2012）；BPV-9型和BPV-10型可引起乳房的鳞状上皮乳头瘤，而皮肤乳头瘤的发生可能还与BPV-3型有关（Batista et a1.，2013）；BPV-5型和BPV-8型可引起纤维乳头状瘤和真皮乳头状瘤（Tomitaet a1.，2007），但至今未见BPV-7型具有致病性的报道。本研究结果表明，从广西隆安县某黄牛养殖场青年黄牛皮肤瘤状物中分离获得的BPV-GX-LA150909毒株无论是基因组还是L1基因，均与BPV-1型的同源性最高，尤其与BPV一1 GZLZ的同源性分别为99.9%和99.7%，且在系统发育进化树上也是与BPV-1GZLZ的遗传距离较近，可能是该分离毒株与BPV-1GZLZ具有相同的来源。这与近年广西从区外大量引进牛种有关，随着牛市交易的频繁，给BPV等病源的传播创造了条件，从而给广西养牛行业的持续健康发展带来巨大挑战。
L1基因较保守，具有重要的生物学功能，常作为乳头瘤病毒基因型的鉴定指标（史巧芸等，2015）。L1基因编码的衣壳蛋白暴露在病毒粒子表面，可能与病毒感染及免疫有关（Doorbar，2005）。此外，L1基因能自我组装成病毒样颗粒，但无致瘤活性，是研制疫苗的候选基因。因此，越来越多的学者开始致力于L1基因研究。贺志昊等（2014）、赵天靖等（2015）分别对BPV-2型和BPV-13型的L1基因进行克隆及原核表达，均证明L1蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。本研究采用Protean对分离毒株的L1蛋白进行B抗原表位预测，结果表明，BPV-GX-LA1 50909毒株的L1蛋白具有潜在的B细胞抗原表位，但是否能引起机体免疫反应、产生特异性抗体，还需进一步研究验证。糖基化是在酶的控制下，将糖转移至蛋白质并与蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键的过程。O-糖基化是将糖链转移到多肽链丝氨酸（ser）或苏氨酸（Thr）的羟基氧原子上（连高焱和俞飚，2012），O-糖链的功能是维持与连接蛋白质的空间构象，起保护作用（刘可人等，2006）；而N-糖基化位点与O-糖基化位点不同，其保守序列是N-X-S/T，其中X是除脯氨酸（P）以外的其他氨基酸，N是糖基化位点。病毒表面蛋白发生的N-糖基化在病毒感染和扩散等方面发挥着重要作用。本研究发现BPV-GX-LA150909毒株的L1蛋白含有17个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点，可能与蛋白正确折叠及增加蛋白的稳定性有关。蛋白糖基化是连接蛋白质和糖类的桥梁，因此下一步需加强对BPV L1蛋白糖基化的研究，为阐明其发病机制及早期诊断治疗提供科学依据。
4结论
广西黄牛群中已存在BPV-1型感染，且与国内外BPV-1型的同源性较高，说明BPV跨地區传播是不可忽视的问题。
（责任编辑 兰宗宝）