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【摘 要】文章建立一种用全自动凯氏定氮仪测定板栗中粗蛋白含量的方法，通过板栗与硫酸和催化剂一同加热消解，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为粗蛋白含量。结果表明：采用全自动凯氏定氮仪测定（NH4）2SO4标准品氮回收率为99.8%～99.9%，测定板栗粗蛋白含量平均为4.1894%，相对标准偏差为0.28%（<10%）（n=6）。说明该方法具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，相对偏差小，是板栗种仁中粗蛋白测定的首选方法。
【关键词】板栗;粗蛋白;凯氏定氮法;消解;蒸馏
【中图分类号】S7 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2020）12-0081-03
板栗（Castanea mollissima Bl.），是壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea）坚果类植物[1]，生长于海拔370～2 800 m的区域，广泛分布在越南、中国等国家，现主要以人工栽培为主[2]。板栗营养丰富，含有大量淀粉、蛋白质、脂肪、B族维生素等多种营养素，被称为“干果之王[3]。板栗中蛋白质含有18氨基酸，其中谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸的含量较高，有8种人体必需氨基酸，它们的含量占氨基酸总含量的33.59%[4]。
食品中蛋白质的测定方法有两类：直接法和间接法[5]。杜马斯燃烧法和凯氏定氮法是使用最广泛的间接法[6-7]，而近红外光谱法、紫外分光光度法、电泳法、紫外吸收光谱法和Bradford法是常见的直接法[5]。凯氏定氮法因灵敏度高、稳定性好、成本低廉，是目前进行氮含量测定常见的方法，也是国内外法定的检测方法[8]。目前，大量文献报道了凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量，但针对特定食品蛋白质的研究仅限于大豆、小麦、乳制品和大米[9-15]。食品基质复杂，普适性方法需要根据实际情况进行适当调整和改进，有必要针对性地建立核桃蛋白质检测方法，在最短的时间内得到更精准的结果。本实验参照《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中的凯氏定氮法测定板栗种仁中粗蛋白含量[16]，通过方法优化，得到精准的含量值，为板栗种仁粗蛋白快速、准确测定提供了科学参考。
方法原理：蛋白质是含氮的有机化合物。板栗果实中的粗蛋白与硫酸和催化剂一同加热消解，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量;其反应式如下：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（1）
（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O（2）
2NH3+4H3BO3→（NH4）2B3O7+5H2O（3）
（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3（4）
1 试剂和材料
1.1 试剂
本实验方法所用试剂均为分析纯，水为三级水。试剂包括五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、硫酸钾（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、甲基红指示剂（C15H15N3O2）、溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）、氢氧化钠（NaOH）、95% 乙醇（C2H5OH）、盐酸（HCl）、无水碳酸钠（Na2CO3）基准试剂、硫酸铵（（NH4）2SO4）标准品。
1.2 试剂配制
（1）硼酸溶液（20 g/L）：称取20 g硼酸，加水溶解后，稀释至1 000 mL。
（2）氢氧化钠溶液（30%）：称取300 g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至1 000 mL。
（3）盐酸标准滴定溶液[C（HCl）]0.1 moL/L：量取9 mL分析纯浓盐酸（HCl）于1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀;称取于270～300 ℃高温炉中灼烧至恒量的工作基准试剂无水碳酸钠0.2 g（精确到0.000 1 g）溶于50 mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2 min，加盖具钠石灰管的橡胶塞，冷却，继续滴定至溶液再呈暗红色;同时做空白试验，准确计算盐酸标准滴定溶液浓度[C（HCl）]。
（4）甲基红乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1 g甲基红溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
（5）溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1 g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
（6）混合指示液：1份甲基红乙醇溶液与3份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
（7）吸收液：硼酸溶液（20 g/L）和混合指示液均匀混合而成。
1.3 仪器和设备
ME204/02型分析天平[感量为1 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产]，K12A全自动凯氏定氮仪（上海晟声自动化分析仪器有限公司生产），SH230N石墨炉消解仪（山东海能科学仪器有限公司生产），DFT-200C超高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司生产），101-2ES电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司生产）。
2 实验步骤
2.1 采收
本实验的板栗果实采自广西百色市隆林县，采收方法有两种，即拾栗法和打粟法。拾栗法就是待栗充分成热，自然落地后，人工拾栗实。打栗法就是分散分批地将成熟的栗苞用竹竿轻轻打落，然后将栗苞、栗实拣拾干净。
2.2 制样
板栗进行暴晒后去壳，在110 ℃电热鼓风干燥箱内干燥1～2 h，用超高速粉碎機粉碎，装入塑料瓶中备用。 2.3 消解
消解药品：浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜。板栗消解条件：称取板栗样品0.5 g（精确至0.000 1 g）于干燥消解管内，依次加入3.5 g硫酸钾、0.5 g硫酸铜、10 mL浓硫酸，消解过程采用曲线升温模式，设定消解炉消解参数：一阶段220 ℃维持20 min，二阶段420 ℃维持60 min（消解炉可提前预热至220 ℃），放入样品，打开尾气回收，待时间结束，可观察样品，与试剂空白一样呈澄清，有淡绿色即为消解完全，静置冷却。
2.4 蒸馏
检查并补充蒸馏水桶、碱液桶、硼酸桶、标液瓶内试剂;打开电源开关，同时打开自来水阀;在“维护”栏“初始化滴定器”1次，“清洗滴定缸”3次;开机时，手动先排空酸、碱管气体（点击“维护”再点击“酸泵”“碱泵”），并置换标液（点击“初始化滴定器”3次），点击“清洗滴定缸”3次;点击“参数设置”输入“标液浓度”“换算系数”数值;安装一空消化管，关闭安全门，点击“测试”，点击“工作模式”选择“空白测试”，设置碱液量为10 mL，吸收液量为30 mL，点击“运行”空蒸，当连续两次空白值相差不大于0.1 mL，取后一次空白值为仪器空白（消解样空白此时可测），然后把空白值输入“维护”中“参数设置”输入“空白”数据;测定前应该先用（NH4）2SO4标准品做氮回收率的测定，借以验证所用仪器、试剂及操作等条件的可靠性;要求（NH4）2SO4标准品氮回收率在95%～105%;点击“测试”依次输入“样品量”“吸收液量”（30 mL）“碱液量（60 mL）”，然后安装样品，点击“运行”。工作完成后，点击“数据”寻找对应的样品编号，点击编号调出测试结果，并记录;全部测试结束，点击“维护”“清洗滴定缸”，关闭电源、水源。
2.5 数据处理
板栗样品中蛋白质的含量按下面的公式计算：
上式中：X为试样中蛋白质的含量，单位为g/100 g;V1为试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL;V2为试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL;C为硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为mol/L;0.014 0为盐酸[C（HCl）=1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为g;m为试样的质量，单位为g;V3为吸取消化液的体积，单位为mL;F为氮换算为蛋白质的系数，板栗中氮转换系数为5.30;100为换算系数。
3 结果与讨论
以K12A全自动凯氏定氮仪测定板栗种仁中粗蛋白含量，其中蒸馏（NH44）2SO4标准品的氮回收率见表1，板栗样品中的蛋白质含量见表2。板栗果实中粗蛋白质含量平均为4.189 4%，该板栗样品测定的粗蛋白符合《GH/T 1029—2002板栗》中蛋白质理化要求≥3.4%的要求。本实验采用K12A全自动凯氏定氮仪测定板栗果实中粗蛋白质的含量具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，测定板栗果实中粗蛋白质含量的相对标准偏差为0.28%（<10%，n=6），相对偏差小，是板栗果实中粗蛋白质含量测定的首选方法。
使用K12A全自动凯氏定氮仪测定板栗果实中的粗蛋白质所得结果误差符合《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）标准要求的两个测定值的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
4 结语
本文采用全自动凯氏定氮法测定广西百色地区板栗种仁的粗蛋白，测定板栗粗蛋白含量平均为4.189 4%，相对标准偏差为0.28%（<10%，n=6）。全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质，具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，相对偏差小，是板栗种仁中粗蛋白测定的首选方法。
参 考 文 献
[1]周葵，张雅媛，黄会玲，等.不同产地生熟板栗品质分析[J/OL].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/43.1183.TS.
20200527.1610.003.html，2020-05-27.
[2]百麗，赵发宝.速溶板栗淀粉的制备和性质研究[D].合肥：安徽农业大学，2011.
[3]张乐，王赵改，杨慧，等.不同板栗品种营养成分及风味物质分析[J].食品科学，2016，37（10）：164-169.
[4]杨燕强.赵发宝.板栗蛋白质的提取及多肽的制备[J].山西农业大学学报（自然科学版），2011，31（1）：73-76.
[5]郭应时，曹小彦，邹杭君，等.全自动凯氏定氮仪测定大米蛋白质[J].食品与机械，2017，33（11）：67-71.
[6]秦琳，黄世群，仲伶俐，等.杜马斯燃烧法和凯氏定氮法在稻米蛋白质检测中的对比研究[J].中国稻米，2019
（5）：69-74.
[7]李晓艳.浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质注意事项[J].计量与测试技术，2008，35（8）：74-75.
[8]郭颖娜，孙卫.蛋白质含量测定方法的比较[J].煤炭与化工，2008，31（4）：36-37.
[9]杨燕强.赵发宝.大豆分离蛋白中蛋白质含量的快速测定[J].粮油食品科技，2007，15（5）：59-61.
[10]俞晓玉，王树成，高娃，等.粮食中蛋白质含量的测定[J].广东化工，2017，44（4）：114-115.
[11]史玮，孙莹，徐振斌.凯氏定氨法测定粮食蛋白质含量方法研究[J].粮食科技与经济，2013，38（5）：31-32.
[12]徐丽丽，侯冬岩，回瑞华，等.乳制品中蛋白质含量的测定[J].鞍山师范学院报，2006，8（4）：40-42.
[13]孙建平，侯彩云.稻米蛋白质测定方法的比较与分析[J].食品科技，2005（6）：78-81.
[14]徐新娟，黄中文，王伟，等.全自动凯氏定氮仪测定大豆蛋白质方法的研究[J].黑龙江农业科学，2016（2）：108-110.
[15]杨耐德.凯氏定氮仪测定小麦粉蛋白质含量的不确定度评定[J].粮油加工，2009（7）：86-88.
[16]GB 5009.5—2016，食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].
【关键词】板栗;粗蛋白;凯氏定氮法;消解;蒸馏
【中图分类号】S7 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2020）12-0081-03
板栗（Castanea mollissima Bl.），是壳斗科（Fagaceae）栗属（Castanea）坚果类植物[1]，生长于海拔370～2 800 m的区域，广泛分布在越南、中国等国家，现主要以人工栽培为主[2]。板栗营养丰富，含有大量淀粉、蛋白质、脂肪、B族维生素等多种营养素，被称为“干果之王[3]。板栗中蛋白质含有18氨基酸，其中谷氨酸、天门冬氨酸、亮氨酸和赖氨酸的含量较高，有8种人体必需氨基酸，它们的含量占氨基酸总含量的33.59%[4]。
食品中蛋白质的测定方法有两类：直接法和间接法[5]。杜马斯燃烧法和凯氏定氮法是使用最广泛的间接法[6-7]，而近红外光谱法、紫外分光光度法、电泳法、紫外吸收光谱法和Bradford法是常见的直接法[5]。凯氏定氮法因灵敏度高、稳定性好、成本低廉，是目前进行氮含量测定常见的方法，也是国内外法定的检测方法[8]。目前，大量文献报道了凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量，但针对特定食品蛋白质的研究仅限于大豆、小麦、乳制品和大米[9-15]。食品基质复杂，普适性方法需要根据实际情况进行适当调整和改进，有必要针对性地建立核桃蛋白质检测方法，在最短的时间内得到更精准的结果。本实验参照《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）中的凯氏定氮法测定板栗种仁中粗蛋白含量[16]，通过方法优化，得到精准的含量值，为板栗种仁粗蛋白快速、准确测定提供了科学参考。
方法原理：蛋白质是含氮的有机化合物。板栗果实中的粗蛋白与硫酸和催化剂一同加热消解，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量;其反应式如下：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4→（NH）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O（1）
（NH4）2SO4+2NaOH→2NH3+Na2SO4+2H2O（2）
2NH3+4H3BO3→（NH4）2B3O7+5H2O（3）
（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3（4）
1 试剂和材料
1.1 试剂
本实验方法所用试剂均为分析纯，水为三级水。试剂包括五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、硫酸钾（K2SO4）、硫酸（H2SO4）、硼酸（H3BO3）、甲基红指示剂（C15H15N3O2）、溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）、氢氧化钠（NaOH）、95% 乙醇（C2H5OH）、盐酸（HCl）、无水碳酸钠（Na2CO3）基准试剂、硫酸铵（（NH4）2SO4）标准品。
1.2 试剂配制
（1）硼酸溶液（20 g/L）：称取20 g硼酸，加水溶解后，稀释至1 000 mL。
（2）氢氧化钠溶液（30%）：称取300 g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至1 000 mL。
（3）盐酸标准滴定溶液[C（HCl）]0.1 moL/L：量取9 mL分析纯浓盐酸（HCl）于1 000 mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀;称取于270～300 ℃高温炉中灼烧至恒量的工作基准试剂无水碳酸钠0.2 g（精确到0.000 1 g）溶于50 mL水中，加10滴溴甲酚绿-甲基红指示液，用配制的盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色，煮沸2 min，加盖具钠石灰管的橡胶塞，冷却，继续滴定至溶液再呈暗红色;同时做空白试验，准确计算盐酸标准滴定溶液浓度[C（HCl）]。
（4）甲基红乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1 g甲基红溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
（5）溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1 g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。
（6）混合指示液：1份甲基红乙醇溶液与3份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。
（7）吸收液：硼酸溶液（20 g/L）和混合指示液均匀混合而成。
1.3 仪器和设备
ME204/02型分析天平[感量为1 mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司生产]，K12A全自动凯氏定氮仪（上海晟声自动化分析仪器有限公司生产），SH230N石墨炉消解仪（山东海能科学仪器有限公司生产），DFT-200C超高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司生产），101-2ES电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司生产）。
2 实验步骤
2.1 采收
本实验的板栗果实采自广西百色市隆林县，采收方法有两种，即拾栗法和打粟法。拾栗法就是待栗充分成热，自然落地后，人工拾栗实。打栗法就是分散分批地将成熟的栗苞用竹竿轻轻打落，然后将栗苞、栗实拣拾干净。
2.2 制样
板栗进行暴晒后去壳，在110 ℃电热鼓风干燥箱内干燥1～2 h，用超高速粉碎機粉碎，装入塑料瓶中备用。 2.3 消解
消解药品：浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜。板栗消解条件：称取板栗样品0.5 g（精确至0.000 1 g）于干燥消解管内，依次加入3.5 g硫酸钾、0.5 g硫酸铜、10 mL浓硫酸，消解过程采用曲线升温模式，设定消解炉消解参数：一阶段220 ℃维持20 min，二阶段420 ℃维持60 min（消解炉可提前预热至220 ℃），放入样品，打开尾气回收，待时间结束，可观察样品，与试剂空白一样呈澄清，有淡绿色即为消解完全，静置冷却。
2.4 蒸馏
检查并补充蒸馏水桶、碱液桶、硼酸桶、标液瓶内试剂;打开电源开关，同时打开自来水阀;在“维护”栏“初始化滴定器”1次，“清洗滴定缸”3次;开机时，手动先排空酸、碱管气体（点击“维护”再点击“酸泵”“碱泵”），并置换标液（点击“初始化滴定器”3次），点击“清洗滴定缸”3次;点击“参数设置”输入“标液浓度”“换算系数”数值;安装一空消化管，关闭安全门，点击“测试”，点击“工作模式”选择“空白测试”，设置碱液量为10 mL，吸收液量为30 mL，点击“运行”空蒸，当连续两次空白值相差不大于0.1 mL，取后一次空白值为仪器空白（消解样空白此时可测），然后把空白值输入“维护”中“参数设置”输入“空白”数据;测定前应该先用（NH4）2SO4标准品做氮回收率的测定，借以验证所用仪器、试剂及操作等条件的可靠性;要求（NH4）2SO4标准品氮回收率在95%～105%;点击“测试”依次输入“样品量”“吸收液量”（30 mL）“碱液量（60 mL）”，然后安装样品，点击“运行”。工作完成后，点击“数据”寻找对应的样品编号，点击编号调出测试结果，并记录;全部测试结束，点击“维护”“清洗滴定缸”，关闭电源、水源。
2.5 数据处理
板栗样品中蛋白质的含量按下面的公式计算：
上式中：X为试样中蛋白质的含量，单位为g/100 g;V1为试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL;V2为试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为mL;C为硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为mol/L;0.014 0为盐酸[C（HCl）=1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为g;m为试样的质量，单位为g;V3为吸取消化液的体积，单位为mL;F为氮换算为蛋白质的系数，板栗中氮转换系数为5.30;100为换算系数。
3 结果与讨论
以K12A全自动凯氏定氮仪测定板栗种仁中粗蛋白含量，其中蒸馏（NH44）2SO4标准品的氮回收率见表1，板栗样品中的蛋白质含量见表2。板栗果实中粗蛋白质含量平均为4.189 4%，该板栗样品测定的粗蛋白符合《GH/T 1029—2002板栗》中蛋白质理化要求≥3.4%的要求。本实验采用K12A全自动凯氏定氮仪测定板栗果实中粗蛋白质的含量具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，测定板栗果实中粗蛋白质含量的相对标准偏差为0.28%（<10%，n=6），相对偏差小，是板栗果实中粗蛋白质含量测定的首选方法。
使用K12A全自动凯氏定氮仪测定板栗果实中的粗蛋白质所得结果误差符合《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）标准要求的两个测定值的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
4 结语
本文采用全自动凯氏定氮法测定广西百色地区板栗种仁的粗蛋白，测定板栗粗蛋白含量平均为4.189 4%，相对标准偏差为0.28%（<10%，n=6）。全自动凯氏定氮仪测定食品中蛋白质，具有准确、快速、简便、低耗、稳定的优点，相对偏差小，是板栗种仁中粗蛋白测定的首选方法。
参 考 文 献
[1]周葵，张雅媛，黄会玲，等.不同产地生熟板栗品质分析[J/OL].http：//kns.cnki.net/kcms/detail/43.1183.TS.
20200527.1610.003.html，2020-05-27.
[2]百麗，赵发宝.速溶板栗淀粉的制备和性质研究[D].合肥：安徽农业大学，2011.
[3]张乐，王赵改，杨慧，等.不同板栗品种营养成分及风味物质分析[J].食品科学，2016，37（10）：164-169.
[4]杨燕强.赵发宝.板栗蛋白质的提取及多肽的制备[J].山西农业大学学报（自然科学版），2011，31（1）：73-76.
[5]郭应时，曹小彦，邹杭君，等.全自动凯氏定氮仪测定大米蛋白质[J].食品与机械，2017，33（11）：67-71.
[6]秦琳，黄世群，仲伶俐，等.杜马斯燃烧法和凯氏定氮法在稻米蛋白质检测中的对比研究[J].中国稻米，2019
（5）：69-74.
[7]李晓艳.浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质注意事项[J].计量与测试技术，2008，35（8）：74-75.
[8]郭颖娜，孙卫.蛋白质含量测定方法的比较[J].煤炭与化工，2008，31（4）：36-37.
[9]杨燕强.赵发宝.大豆分离蛋白中蛋白质含量的快速测定[J].粮油食品科技，2007，15（5）：59-61.
[10]俞晓玉，王树成，高娃，等.粮食中蛋白质含量的测定[J].广东化工，2017，44（4）：114-115.
[11]史玮，孙莹，徐振斌.凯氏定氨法测定粮食蛋白质含量方法研究[J].粮食科技与经济，2013，38（5）：31-32.
[12]徐丽丽，侯冬岩，回瑞华，等.乳制品中蛋白质含量的测定[J].鞍山师范学院报，2006，8（4）：40-42.
[13]孙建平，侯彩云.稻米蛋白质测定方法的比较与分析[J].食品科技，2005（6）：78-81.
[14]徐新娟，黄中文，王伟，等.全自动凯氏定氮仪测定大豆蛋白质方法的研究[J].黑龙江农业科学，2016（2）：108-110.
[15]杨耐德.凯氏定氮仪测定小麦粉蛋白质含量的不确定度评定[J].粮油加工，2009（7）：86-88.
[16]GB 5009.5—2016，食品安全国家标准食品中蛋白质的测定[S].