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基金项目 开封市科技攻关项目(110336)
摘 要 目的：观察反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌手术切除后转移和复发的影响。方法：将小鼠4T1乳腺癌细胞植入雌性BALB/c小鼠乳房脂肪垫下。乳腺癌直径达10mm时手术切除，次日开始分别用50mg/kg的反应停和25mg/kg的他莫昔芬单独及联合治疗小鼠3周。治疗效果通过小鼠术后转移和复发率、小鼠血清中Na+，K+，Cl-，glu水平及小鼠存活时间评价。结果：对照组、他莫昔芬组、反应停组、反应停联合他莫昔芬组乳腺癌复发率分别为75%、80%、60%和20%；肺内出现转移灶率分别为80%、100%、50%和25%。与对照组比较，他莫昔芬治疗小鼠血清Cl-和K+升高，Na+和glu降低。反应停及反应停联合他莫昔芬治疗小鼠血清Cl-、Na+、K+和glu与正常小鼠相似。结论：反应停联合他莫昔芬能促进机体电解质平衡，可以用于预防乳腺癌术后转移和复发。
关键词 反应停 他莫昔芬 乳腺癌 肿瘤复发 电解质平衡
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.01.002
Abstract Objective:To investigate the effect of thalidomide combined with tamoxifen on metastasis and recurrence of breast cancer(4T1)after the tumor removal in mice.Methods:4T1 breast cancer cells were injected into the second mammary fat pad of BALB/c mice.The breast cancer was removed by operation when it reached a diameter of 10mm,next day,the treatment was initiated with 25 mg/kg of thalidomide and/or 50mg/kg of tamoxifen for 3w.The therapeutic efficacy was evaluated by the rate of metastasis and recurrence,serum Na+,K+,Cl-,glu and life span in mice.Results:The rates of tumor recurrence were 75%、80%、60% and 20% in the control.tamoxifen.thalidomide and thalidomide combined with tamoxifen groups.respectively.The pulmonary metastasis rates were 80%，100%，50% and 25% in control,tamoxifen,thalidomide and thalidomide combined with tamoxifen groups,respectively.Compared with the control group,serum Cl- and K+ significantly increased and Na+ and glu decreased in tamoxifen group,whereas Na+,K+,Cl- and glu in thalidomide and thalidomide combined with tamoxifen groups were similar to control group.Conclusion:It is very important for controlling tumor metastasis and recurrence to recover host electrolyte balance after the tumor removal.Thalidomide combined with tamoxifen can promote the host electrolyte balance,which might be used for preventing metastasis and recurrence after breast cancer removal.
Key Words Thalidomide;Tamoxifen;Breast cancer;Tumor recurrence;Electrolyte balance
乳腺癌患者死亡的主要原因是手术切除后肿瘤转移和复发。他莫昔芬(TAM)是雌激素受体阳性乳腺肿瘤内分泌治疗的首选药物，但许多乳腺癌患者特别是部分绝经期后的乳腺癌患者由于雌激素受体(ER)表达缺失对TAM不敏感［1］。临床报道反应停治疗晚期乳腺癌疗效显著［2］，将反应停与他莫昔芬联合，在雌激素受体阴性小鼠乳腺癌模型中观察了其对小鼠乳腺癌术后复发和转移的影响。
资料与方法
实验材料：①试剂：沙利度胺(反应停)片，用时0.5%的CMC-Na混悬成适当浓度。枸橼酸他莫昔芬片，用时0.5%的CMC-Na混悬成适当浓度。血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-α ELISA试剂盒。②实验动物及瘤株：BALB/c小鼠，雌性，18～22g；4T1乳腺癌瘤株由中科院生物物理研究所梁伟教授惠赠，本实验室于BABL/c小鼠在体传代保存。③主要仪器：酶标仪：Elx800型，BIO-TEK。
实验方法：①小鼠乳腺癌模型：取接种2周生长良好的小鼠4T1乳腺癌组织，用生理盐水研磨制备成5×106个细胞/ml悬液，以0.1ml/只接种于120只雌性BALB/c小鼠的第二乳房脂肪垫下。待乳腺癌长至直径10mm时无菌手术切除。②分组及治疗：乳腺癌切除术后次日，将小鼠随机分成4 组，每组30只。模型对照组：2次/日灌胃生理盐水；反应停组：每天灌胃反应停50mg/kg体重2次；他莫昔芬组：每天灌胃他莫昔芬25mg/kg体重2次；联合治疗组：每天灌胃反应停50mg/kg+他莫昔芬25mg/kg体重2次。每天上午9点和下午5点给药，各组灌胃容积均0.2ml/10g体重，连续给药3周。③疗效评价：手术后每周监测小鼠手术切除部位肿瘤及小鼠体重2次，切除肿瘤后第22天每组取10只小鼠采血，分离血清，-20℃储存用于检测血清Na+，K+，Cl-，glu水平。其余每組20只小鼠观察术后120天内存活情况，小鼠死后检测手术切除部位肿瘤及肺转移灶，统计肿瘤复发和转移率。④葡萄糖测定：采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法。血清中葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化氢酶的作用下，将还原性4-氨基安替比林与酚偶联缩合成醌类化合物，酶标仪505nm测定标准管和样品管吸光度，计算其含量。葡萄糖(mmol/L)=样本管吸光度(A)/校准管吸光度(A)×校准液浓度。⑤钠离子测定：在分散剂和除干扰剂的存在下，6-氢氧化锑钾在分散剂的存在下与钠离子形成均一的浓度。在630nm处用酶标仪测定标准管和样品管吸光度，测定其含量。钠离子含量(mmol/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度。⑥钾离子的测定(比浊法)：碱性介质中，经蛋白沉淀剂处理后的血清样本中的钾离子与NA-TPB反应产生浑浊并有稳定的悬浮液，浑浊度与样本中钾离子浓度成正比，440nm测定吸光度。钾离子含量(mmol/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度×样本测试前稀释倍数(10)。⑦氯离子测定：用硫氰酸汞处理氯离子形成有色络合物，其颜色的深度与氯离子浓度成正比，480nm酶标仪测定标准管和样品管吸光度，计算其含量。氯离子含量(mmol/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×100mmol/L。
统计学处理：数据以(X±S)表示，组间差异用单向方差分析(ANOVA)，两组间差异用student's t检验，经SPSS10.0进行，P＜0.05为有统计学差异。
结 果
反应停联合他莫昔芬对乳腺癌切除后肿瘤转移和复发的影响对照组、他莫昔芬组、反应停组、反应停联合他莫昔芬组乳腺癌复发率分别为75%、80%、60%和20%；肺内出现转移灶率分别为80%、100%、50%和25%，见表1。
反应停联合他莫昔芬对乳腺癌切除后小鼠存活时间的影响：对照组及各治疗组乳腺癌切除后肿瘤复发及转移小鼠120天内全部死亡，对照组死亡小鼠存活时间73.1±16.5天，他莫昔芬治疗组死亡小鼠存活时间74.0±16.2天，反应停治疗组死亡小鼠存活时间85.2±16.9天，而反应停联合他莫昔芬治疗组死亡小鼠平均存活时间106.3±7.9天，剩余小鼠至肿瘤切除后120天观察结束无转移和复发(见图1)。
反应停联合他莫昔芬对乳腺癌切除后小鼠血液电解质平衡的影响：与正常小鼠比较，乳腺癌术后对照组小鼠血清Cl-、Na+、K+浓度均降低，而葡萄糖含量偏高。与对照组比较，他莫昔芬组治疗组小鼠血清Cl-和K+升高，Na+和glu降低。反应停及反应停联合他莫昔芬组治疗小鼠血清Cl-、Na+、K+和glu与正常小鼠相似，见表2。
讨 论
手术切除是乳腺癌最常见的治疗方法，但肿瘤切除后的转移和复发是肿瘤致患者死亡的主要原因。乳腺癌手术过程涉及范围广，体液流失多，手术后常有机体电解质紊乱，可能是乳腺癌术后肿瘤复发和转移的原因之一［3］。为了减少肿瘤转移和复发，临床上多采用手术后放疗或化疗方案，可能有加重电解质紊乱的危险［4］。本文观察了反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌术后复发和转移的影响，有与临床肿瘤术后电解质紊乱相同现象［5］。术后肿瘤复发与转移结果表明，他莫昔芬单独应用不能阻止术后肿瘤复发和转移，反应停单独使用有一定阻止肿瘤复发和转移作用，而反应停联合他莫昔芬有较好的阻止肿瘤复发和转移作用，与治疗后有无电解质紊乱结果一致。在其他实验中发现反应停有使他莫昔芬对雌激素受体阴性乳腺癌敏感作用，因此认为，电解质平衡对乳腺癌术后肿瘤复发和转移非常重要，但必要的抗肿瘤措施也是预防术后肿瘤复发和转移所必需的。
参考文献
1 邢风玲,陈雪芹,冯力民,等.绝经后服用他莫昔芬的乳腺癌患者子宫内膜中PTEN的表达［J］.首都医科大学学报,2010,31(3):405-408.
2 李书芹,孙国锋,赵卫红.TP方案联合沙利度胺治疗晚期乳腺癌［J］.临床医学,2009,29(1):74-75.
3 林蓓.婦科肿瘤术后肠道菌群失调及水、电解质紊乱的防治［J］.中国实用妇科与产科杂志,2009,25(7):498-501.
4 尹晓然,王西京,刘小旭,等.宫颈小细胞癌同步放化疗诱发严重电解质紊乱1例［J］.中国现代医学杂志,2009,19(12):1290.
5 刘霞,孙红艳,王可.鞍区肿瘤术后电解质紊乱的观察及护理［J］.中国病案,2010,11(11):24-25.
摘 要 目的：观察反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌手术切除后转移和复发的影响。方法：将小鼠4T1乳腺癌细胞植入雌性BALB/c小鼠乳房脂肪垫下。乳腺癌直径达10mm时手术切除，次日开始分别用50mg/kg的反应停和25mg/kg的他莫昔芬单独及联合治疗小鼠3周。治疗效果通过小鼠术后转移和复发率、小鼠血清中Na+，K+，Cl-，glu水平及小鼠存活时间评价。结果：对照组、他莫昔芬组、反应停组、反应停联合他莫昔芬组乳腺癌复发率分别为75%、80%、60%和20%；肺内出现转移灶率分别为80%、100%、50%和25%。与对照组比较，他莫昔芬治疗小鼠血清Cl-和K+升高，Na+和glu降低。反应停及反应停联合他莫昔芬治疗小鼠血清Cl-、Na+、K+和glu与正常小鼠相似。结论：反应停联合他莫昔芬能促进机体电解质平衡，可以用于预防乳腺癌术后转移和复发。
关键词 反应停 他莫昔芬 乳腺癌 肿瘤复发 电解质平衡
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.01.002
Abstract Objective:To investigate the effect of thalidomide combined with tamoxifen on metastasis and recurrence of breast cancer(4T1)after the tumor removal in mice.Methods:4T1 breast cancer cells were injected into the second mammary fat pad of BALB/c mice.The breast cancer was removed by operation when it reached a diameter of 10mm,next day,the treatment was initiated with 25 mg/kg of thalidomide and/or 50mg/kg of tamoxifen for 3w.The therapeutic efficacy was evaluated by the rate of metastasis and recurrence,serum Na+,K+,Cl-,glu and life span in mice.Results:The rates of tumor recurrence were 75%、80%、60% and 20% in the control.tamoxifen.thalidomide and thalidomide combined with tamoxifen groups.respectively.The pulmonary metastasis rates were 80%，100%，50% and 25% in control,tamoxifen,thalidomide and thalidomide combined with tamoxifen groups,respectively.Compared with the control group,serum Cl- and K+ significantly increased and Na+ and glu decreased in tamoxifen group,whereas Na+,K+,Cl- and glu in thalidomide and thalidomide combined with tamoxifen groups were similar to control group.Conclusion:It is very important for controlling tumor metastasis and recurrence to recover host electrolyte balance after the tumor removal.Thalidomide combined with tamoxifen can promote the host electrolyte balance,which might be used for preventing metastasis and recurrence after breast cancer removal.
Key Words Thalidomide;Tamoxifen;Breast cancer;Tumor recurrence;Electrolyte balance
乳腺癌患者死亡的主要原因是手术切除后肿瘤转移和复发。他莫昔芬(TAM)是雌激素受体阳性乳腺肿瘤内分泌治疗的首选药物，但许多乳腺癌患者特别是部分绝经期后的乳腺癌患者由于雌激素受体(ER)表达缺失对TAM不敏感［1］。临床报道反应停治疗晚期乳腺癌疗效显著［2］，将反应停与他莫昔芬联合，在雌激素受体阴性小鼠乳腺癌模型中观察了其对小鼠乳腺癌术后复发和转移的影响。
资料与方法
实验材料：①试剂：沙利度胺(反应停)片，用时0.5%的CMC-Na混悬成适当浓度。枸橼酸他莫昔芬片，用时0.5%的CMC-Na混悬成适当浓度。血管内皮生长因子VEGF和肿瘤坏死因子TNF-α ELISA试剂盒。②实验动物及瘤株：BALB/c小鼠，雌性，18～22g；4T1乳腺癌瘤株由中科院生物物理研究所梁伟教授惠赠，本实验室于BABL/c小鼠在体传代保存。③主要仪器：酶标仪：Elx800型，BIO-TEK。
实验方法：①小鼠乳腺癌模型：取接种2周生长良好的小鼠4T1乳腺癌组织，用生理盐水研磨制备成5×106个细胞/ml悬液，以0.1ml/只接种于120只雌性BALB/c小鼠的第二乳房脂肪垫下。待乳腺癌长至直径10mm时无菌手术切除。②分组及治疗：乳腺癌切除术后次日，将小鼠随机分成4 组，每组30只。模型对照组：2次/日灌胃生理盐水；反应停组：每天灌胃反应停50mg/kg体重2次；他莫昔芬组：每天灌胃他莫昔芬25mg/kg体重2次；联合治疗组：每天灌胃反应停50mg/kg+他莫昔芬25mg/kg体重2次。每天上午9点和下午5点给药，各组灌胃容积均0.2ml/10g体重，连续给药3周。③疗效评价：手术后每周监测小鼠手术切除部位肿瘤及小鼠体重2次，切除肿瘤后第22天每组取10只小鼠采血，分离血清，-20℃储存用于检测血清Na+，K+，Cl-，glu水平。其余每組20只小鼠观察术后120天内存活情况，小鼠死后检测手术切除部位肿瘤及肺转移灶，统计肿瘤复发和转移率。④葡萄糖测定：采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法。血清中葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化氢酶的作用下，将还原性4-氨基安替比林与酚偶联缩合成醌类化合物，酶标仪505nm测定标准管和样品管吸光度，计算其含量。葡萄糖(mmol/L)=样本管吸光度(A)/校准管吸光度(A)×校准液浓度。⑤钠离子测定：在分散剂和除干扰剂的存在下，6-氢氧化锑钾在分散剂的存在下与钠离子形成均一的浓度。在630nm处用酶标仪测定标准管和样品管吸光度，测定其含量。钠离子含量(mmol/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度。⑥钾离子的测定(比浊法)：碱性介质中，经蛋白沉淀剂处理后的血清样本中的钾离子与NA-TPB反应产生浑浊并有稳定的悬浮液，浑浊度与样本中钾离子浓度成正比，440nm测定吸光度。钾离子含量(mmol/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×标准管浓度×样本测试前稀释倍数(10)。⑦氯离子测定：用硫氰酸汞处理氯离子形成有色络合物，其颜色的深度与氯离子浓度成正比，480nm酶标仪测定标准管和样品管吸光度，计算其含量。氯离子含量(mmol/L)=测定管吸光度/标准管吸光度×100mmol/L。
统计学处理：数据以(X±S)表示，组间差异用单向方差分析(ANOVA)，两组间差异用student's t检验，经SPSS10.0进行，P＜0.05为有统计学差异。
结 果
反应停联合他莫昔芬对乳腺癌切除后肿瘤转移和复发的影响对照组、他莫昔芬组、反应停组、反应停联合他莫昔芬组乳腺癌复发率分别为75%、80%、60%和20%；肺内出现转移灶率分别为80%、100%、50%和25%，见表1。
反应停联合他莫昔芬对乳腺癌切除后小鼠存活时间的影响：对照组及各治疗组乳腺癌切除后肿瘤复发及转移小鼠120天内全部死亡，对照组死亡小鼠存活时间73.1±16.5天，他莫昔芬治疗组死亡小鼠存活时间74.0±16.2天，反应停治疗组死亡小鼠存活时间85.2±16.9天，而反应停联合他莫昔芬治疗组死亡小鼠平均存活时间106.3±7.9天，剩余小鼠至肿瘤切除后120天观察结束无转移和复发(见图1)。
反应停联合他莫昔芬对乳腺癌切除后小鼠血液电解质平衡的影响：与正常小鼠比较，乳腺癌术后对照组小鼠血清Cl-、Na+、K+浓度均降低，而葡萄糖含量偏高。与对照组比较，他莫昔芬组治疗组小鼠血清Cl-和K+升高，Na+和glu降低。反应停及反应停联合他莫昔芬组治疗小鼠血清Cl-、Na+、K+和glu与正常小鼠相似，见表2。
讨 论
手术切除是乳腺癌最常见的治疗方法，但肿瘤切除后的转移和复发是肿瘤致患者死亡的主要原因。乳腺癌手术过程涉及范围广，体液流失多，手术后常有机体电解质紊乱，可能是乳腺癌术后肿瘤复发和转移的原因之一［3］。为了减少肿瘤转移和复发，临床上多采用手术后放疗或化疗方案，可能有加重电解质紊乱的危险［4］。本文观察了反应停联合他莫昔芬对小鼠乳腺癌术后复发和转移的影响，有与临床肿瘤术后电解质紊乱相同现象［5］。术后肿瘤复发与转移结果表明，他莫昔芬单独应用不能阻止术后肿瘤复发和转移，反应停单独使用有一定阻止肿瘤复发和转移作用，而反应停联合他莫昔芬有较好的阻止肿瘤复发和转移作用，与治疗后有无电解质紊乱结果一致。在其他实验中发现反应停有使他莫昔芬对雌激素受体阴性乳腺癌敏感作用，因此认为，电解质平衡对乳腺癌术后肿瘤复发和转移非常重要，但必要的抗肿瘤措施也是预防术后肿瘤复发和转移所必需的。
参考文献
1 邢风玲,陈雪芹,冯力民,等.绝经后服用他莫昔芬的乳腺癌患者子宫内膜中PTEN的表达［J］.首都医科大学学报,2010,31(3):405-408.
2 李书芹,孙国锋,赵卫红.TP方案联合沙利度胺治疗晚期乳腺癌［J］.临床医学,2009,29(1):74-75.
3 林蓓.婦科肿瘤术后肠道菌群失调及水、电解质紊乱的防治［J］.中国实用妇科与产科杂志,2009,25(7):498-501.
4 尹晓然,王西京,刘小旭,等.宫颈小细胞癌同步放化疗诱发严重电解质紊乱1例［J］.中国现代医学杂志,2009,19(12):1290.
5 刘霞,孙红艳,王可.鞍区肿瘤术后电解质紊乱的观察及护理［J］.中国病案,2010,11(11):24-25.