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摘要 [目的]开发高纯度费菜总黄酮的分离纯化工艺。[方法]以大孔树脂为载体，对上样量及层析条件进行优化，再进一步采用结晶的方法进行纯化。[结果]选用聚合物纳米微球PS RPC-300作为最佳层析填料，洗脱速度为5 mL/min，洗脱剂为70%乙醇，上样量为5.0 g/kg填料，结晶溶剂为丙酮；在此优化条件下所得产品的纯度为95.1%。[结论]此分离纯化方法简便可靠，分离效果好。
关键词 费菜；总黄酮；聚合物纳米微球；分离纯化
中圖分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0113-02
Abstract [Objective] The research aimed to develop the separation and purification processes of highpurity total flavonoids from Sedum aizoon L.[Method]With the macroporous resin as the carrier，the loading volume and the chromatographic conditions were optimized，and then further purified by crystallization method.[Result]Type of PS RPC-300 nanoscale polymer particles was selected as the best chromatography filler.The optimal conditions were as follows：the elution speed was 5.0 mL/min，70% ethanol was used as the eluant，the amount of sample was 5 g/kg filter，and acetone was used as the crystallization solvent.The purity of the final product was 95.1% under the optimal conditions.[Conclusion]The separation and purification method is simple and reliable，and the separation effect is good.
Key words Sedum aizoon L.；Total flavonoids；Polymer nanospheres；Separation and purification
费菜（Sedum aizoon L.）为景天科景天属多年生草本植物，适应性强，分布广泛，在我国陕西、四川、江苏、湖北、山东、宁夏、甘肃、河北等地均有分布[1]。它是一种药食兼用植物，嫩茎叶富含各种营养物质，无任何异味，即可鲜食又可烹调；其根及全草富含生物碱、谷甾醇、齐墩果酸、景庆庚糖、马栗树皮素、杨梅树皮苷、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚、杨梅黄素、3-葡萄糖苷等[2]，对于提高人体免疫力、预防和治疗心脑血管疾病具有较好的效果。
目前，费菜提取物已在食品行业、医药及化妆品行业得到广泛应用[3-4]。但关于高纯度的费菜总黄酮提取物纯化分离的文献报道较少，而且已有的制备提取方法存在收率不高、纯度偏低的缺点[5-6]。因此，笔者以费菜总黄酮粗提物为试材，采用聚合物纳米微球作为层析填料，对其进行层析纯化[7]，得到了纯度较高的总黄酮，以期为费菜提取物的进一步研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 试材
费菜总黄酮粗提物（自制）；芦丁对照品（中国生物制品检定所）。聚合物纳米微球（苏州纳微科技公司）；AB-8大孔树脂（安徽三星科技公司）；201大孔树脂（昆山嘉之美）；去离子水（自制）；乙腈（色谱纯，Thermo公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器 中压层析系统（瑞士Buchi公司）；高效液相色谱仪（996检测器，515泵，Waters公司）；旋转蒸发器（Loborata 4000，Heidolph公司）。
1.3 方法
1.3.1 高效液相检测条件。
色谱柱为Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流动相为甲醇-水-醋酸体积比（48∶50∶2）；流速1.0 mL/min；检测波长275 nm；进样量10 μL。
1.3.2 芦丁标准品制备。
精密称取芦丁对照品12.6 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇温热溶解，并稀释至刻度摇匀备用。
1.3.3 吸附树脂的筛选。分别用型号为PS RPC-300聚合物纳米微球、AB-8、201大孔树脂装柱，取100 g备选树脂用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性，湿法装柱，用去离子水平衡系统。取0.5 g费菜总黄酮粗提物（纯度为30%），用乙醇完全溶解，然后均匀地加样于层析柱，用一倍柱体积的去离子水进行洗涤处理，洗涤后再用不同浓度的乙醇以5 mL/min的速度進行洗脱处理，中压监控收集洗脱液，每管10 mL。高效液相色谱仪检测分离效果，每组试验做3次平行试验，数据取平均值，以备选大孔树脂对总黄酮的洗脱收率进行筛选。
1.3.4 解吸液乙醇浓度的确定。
取0.5 g费菜总黄酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均匀地加样于100 g聚合物纳米微球PS RPC-300树脂柱上，用一倍柱体积去离子水进行洗涤处理，然后分别采用50%、60%、70%、80%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，分管收集乙醇洗脱液，通过中压层析色谱检测器在线监测，以观察总黄酮解吸状况。 1.3.5 解吸液流速的选择。
取0.5 g费菜总黄酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均匀地加样于100 g聚合物纳米微球PS RPC-300树脂柱上，用一倍柱体积去离子水进行洗涤处理，用70%乙醇作为洗脱剂，然后分别以3、4、5、6、7 mL/min的洗脫速度进行洗脱，收集洗脱液，每管10 mL。高效液相色谱仪检测分离效果，将总黄酮单组分接收液合并，计算洗脱收率。
1.3.6 上样量的确定。
分别按照1 kg聚合物纳米微球PS RPC-300加载2、3、5、8、10 g费菜总黄酮粗提物，用一倍柱体积去离子水进行洗涤处理，然后70%乙醇作为洗脱剂，以5 mL/min的洗脱速度进行洗脱，收集洗脱液，每管10 mL。高效液相色谱仪检测分离效果，将总黄酮单组分接收液合并，计算洗脱收率。
1.3.7 结晶。
将费菜总黄酮单组分的洗脱液合并，减压浓缩处理，再加入适量的丙酮、乙酸乙酯、异丙醇等不同溶剂，抽滤，干燥，得到费菜总黄酮结晶粉，高效液相色谱仪检測各结晶粉含量。
2 结果与分析
2.1 线性关系考察
精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度，摇匀，进样量为10 μL，用液相色谱仪测定，得出回归方程为Y=17 714X-89.686（r=0.999 4），表明总黄酮在0.005 04～0.050 40 mg/mL线性关系良好。
2.2 大孔树脂型号的确定
由图1可知，PS RPC-300聚合物纳米微球在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%时对费菜总黄酮的洗脱收率均高于AB-8、201这2种树脂；并且通过高效液相色谱仪检测，费菜总黄酮单组分的分离效果也高于AB-8、201 这2种树脂，因此该试验层析填料选择PS RPC-300聚合物纳米微球。
2.3 解吸液乙醇浓度的确定
由表1可知，用50%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，洗脱率最低，仅有50.6%；用60%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，解吸拖尾较为严重且解吸率偏低；用80%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，洗脱速度过快，总黄酮单组分不能有效分离；用70%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，分离费菜总黄酮效果好，单组分可以有效洗脱，色谱纯度最高，为91.2%。因此，最佳洗脱条件为：用70%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，中压监测分段收集洗脱液。
2.4 解吸液流速的选择 由图2可知，70%乙醇洗脱速度逐步增加时洗脱收率也随之增加，但当超过5 mL/min时，费菜总黄酮洗脱过快，单组分夹杂杂质。因此，选择洗脱速度为5 mL/min。
2.5 上样量的确定
由图3可知，样品上样量直接影响着层析收率。当费菜总黄酮粗提物上样量在2～10 g/kg时，总黄酮层析收率出现先升高再降低的趋势。当费菜总黄酮上样量为2 g/kg时，样品在解吸过程中分散较为严重，层析收率最低，仅为40.0%左右；随着总黄酮上样量的增加，层析收率有所提高，当达到5 g/kg时，层析收率达到最大值，为78.7%；当上样量再加大时，出现过载现象，费菜总黄酮单组分重叠，层析效果减弱，洗脱收率出现显著下降。因此，筛选出适宜上样量是保证最佳层析收率的基础，在保证分离度的情况下，上样量为5 g/kg时，层析收率最高。
2.6 结晶
由表2可知，丙酮、乙酸乙酯、异丙醇3种结晶溶剂对费菜总黄酮单组分精粉收率、纯度的影响差异较大，其中丙酮的结晶收率偏低，为57.6%，但其能去除部分杂质提高纯度，纯度高达95.1%。因此，综合考虑选用丙酮作为结晶溶剂。
3 结论
以费菜总黄酮粗提物为试材，采用聚合物纳米微球作为层析填料，对其进行层析纯化，结果发现，最优分离纯化方法是：选用聚合物纳米微球PS RPC-300作为最佳层析填料，70%乙醇作为洗脱剂分离纯化，洗脱速度为5 mL/min，上样量为5 g/kg填料，结晶溶剂为丙酮；在此优化条件下能够得到含量为95.1%的总黄酮，总收率为57.6%。该分离纯化方法简便可靠，不但简化了提取工艺，而且提高了成品收率，为费菜提取物的进一步研究提供参考。
参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志 [M].北京：科学出版社，1984：72-74.
[2] 陈华珍，陈建伟.费菜不同器官中总黄酮的含量比较及其薄层鉴别[J].中医药学刊，2003，21（11）：1867，1917.
[3] 王耀辉，强毅，鲁秀兰，等.费菜不同部位原花色素含量分析[J].光谱实验室，2013，30（5）：2529-2534.
[4] 强毅，李江林，王晟昱，等.费菜不同部位氨基酸组成及含量分析[J].光谱实验室，2013，30（2）：1000-1003.
[5] 王鸿飞，刘飞，徐超，等.费菜总黄酮碱法提取工艺及抗氧化活性[J].农业工程学报，2012，28（S1）：317-321.
[6] 刘飞，王鸿飞，林燕，等.费菜总黄酮提取工艺的研究[J].食品工业科技，2011（4）：252-254，257.
[7] 林毅，张雪霞，李宁，等.聚合物纳米微球分离纯化达托霉素方法研究[J].中国抗生素杂志，2013，38（8）：588-591.
关键词 费菜；总黄酮；聚合物纳米微球；分离纯化
中圖分类号 R284.2 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）18-0113-02
Abstract [Objective] The research aimed to develop the separation and purification processes of highpurity total flavonoids from Sedum aizoon L.[Method]With the macroporous resin as the carrier，the loading volume and the chromatographic conditions were optimized，and then further purified by crystallization method.[Result]Type of PS RPC-300 nanoscale polymer particles was selected as the best chromatography filler.The optimal conditions were as follows：the elution speed was 5.0 mL/min，70% ethanol was used as the eluant，the amount of sample was 5 g/kg filter，and acetone was used as the crystallization solvent.The purity of the final product was 95.1% under the optimal conditions.[Conclusion]The separation and purification method is simple and reliable，and the separation effect is good.
Key words Sedum aizoon L.；Total flavonoids；Polymer nanospheres；Separation and purification
费菜（Sedum aizoon L.）为景天科景天属多年生草本植物，适应性强，分布广泛，在我国陕西、四川、江苏、湖北、山东、宁夏、甘肃、河北等地均有分布[1]。它是一种药食兼用植物，嫩茎叶富含各种营养物质，无任何异味，即可鲜食又可烹调；其根及全草富含生物碱、谷甾醇、齐墩果酸、景庆庚糖、马栗树皮素、杨梅树皮苷、金丝桃苷、槲皮素、山奈酚、杨梅黄素、3-葡萄糖苷等[2]，对于提高人体免疫力、预防和治疗心脑血管疾病具有较好的效果。
目前，费菜提取物已在食品行业、医药及化妆品行业得到广泛应用[3-4]。但关于高纯度的费菜总黄酮提取物纯化分离的文献报道较少，而且已有的制备提取方法存在收率不高、纯度偏低的缺点[5-6]。因此，笔者以费菜总黄酮粗提物为试材，采用聚合物纳米微球作为层析填料，对其进行层析纯化[7]，得到了纯度较高的总黄酮，以期为费菜提取物的进一步研究提供参考。
1 材料与方法
1.1 试材
费菜总黄酮粗提物（自制）；芦丁对照品（中国生物制品检定所）。聚合物纳米微球（苏州纳微科技公司）；AB-8大孔树脂（安徽三星科技公司）；201大孔树脂（昆山嘉之美）；去离子水（自制）；乙腈（色谱纯，Thermo公司）；其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器 中压层析系统（瑞士Buchi公司）；高效液相色谱仪（996检测器，515泵，Waters公司）；旋转蒸发器（Loborata 4000，Heidolph公司）。
1.3 方法
1.3.1 高效液相检测条件。
色谱柱为Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流动相为甲醇-水-醋酸体积比（48∶50∶2）；流速1.0 mL/min；检测波长275 nm；进样量10 μL。
1.3.2 芦丁标准品制备。
精密称取芦丁对照品12.6 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇温热溶解，并稀释至刻度摇匀备用。
1.3.3 吸附树脂的筛选。分别用型号为PS RPC-300聚合物纳米微球、AB-8、201大孔树脂装柱，取100 g备选树脂用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性，湿法装柱，用去离子水平衡系统。取0.5 g费菜总黄酮粗提物（纯度为30%），用乙醇完全溶解，然后均匀地加样于层析柱，用一倍柱体积的去离子水进行洗涤处理，洗涤后再用不同浓度的乙醇以5 mL/min的速度進行洗脱处理，中压监控收集洗脱液，每管10 mL。高效液相色谱仪检测分离效果，每组试验做3次平行试验，数据取平均值，以备选大孔树脂对总黄酮的洗脱收率进行筛选。
1.3.4 解吸液乙醇浓度的确定。
取0.5 g费菜总黄酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均匀地加样于100 g聚合物纳米微球PS RPC-300树脂柱上，用一倍柱体积去离子水进行洗涤处理，然后分别采用50%、60%、70%、80%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，分管收集乙醇洗脱液，通过中压层析色谱检测器在线监测，以观察总黄酮解吸状况。 1.3.5 解吸液流速的选择。
取0.5 g费菜总黄酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均匀地加样于100 g聚合物纳米微球PS RPC-300树脂柱上，用一倍柱体积去离子水进行洗涤处理，用70%乙醇作为洗脱剂，然后分别以3、4、5、6、7 mL/min的洗脫速度进行洗脱，收集洗脱液，每管10 mL。高效液相色谱仪检测分离效果，将总黄酮单组分接收液合并，计算洗脱收率。
1.3.6 上样量的确定。
分别按照1 kg聚合物纳米微球PS RPC-300加载2、3、5、8、10 g费菜总黄酮粗提物，用一倍柱体积去离子水进行洗涤处理，然后70%乙醇作为洗脱剂，以5 mL/min的洗脱速度进行洗脱，收集洗脱液，每管10 mL。高效液相色谱仪检测分离效果，将总黄酮单组分接收液合并，计算洗脱收率。
1.3.7 结晶。
将费菜总黄酮单组分的洗脱液合并，减压浓缩处理，再加入适量的丙酮、乙酸乙酯、异丙醇等不同溶剂，抽滤，干燥，得到费菜总黄酮结晶粉，高效液相色谱仪检測各结晶粉含量。
2 结果与分析
2.1 线性关系考察
精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度，摇匀，进样量为10 μL，用液相色谱仪测定，得出回归方程为Y=17 714X-89.686（r=0.999 4），表明总黄酮在0.005 04～0.050 40 mg/mL线性关系良好。
2.2 大孔树脂型号的确定
由图1可知，PS RPC-300聚合物纳米微球在乙醇浓度为50%、60%、70%、80%时对费菜总黄酮的洗脱收率均高于AB-8、201这2种树脂；并且通过高效液相色谱仪检测，费菜总黄酮单组分的分离效果也高于AB-8、201 这2种树脂，因此该试验层析填料选择PS RPC-300聚合物纳米微球。
2.3 解吸液乙醇浓度的确定
由表1可知，用50%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，洗脱率最低，仅有50.6%；用60%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，解吸拖尾较为严重且解吸率偏低；用80%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，洗脱速度过快，总黄酮单组分不能有效分离；用70%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，分离费菜总黄酮效果好，单组分可以有效洗脱，色谱纯度最高，为91.2%。因此，最佳洗脱条件为：用70%乙醇以5 mL/min的速度进行洗脱，中压监测分段收集洗脱液。
2.4 解吸液流速的选择 由图2可知，70%乙醇洗脱速度逐步增加时洗脱收率也随之增加，但当超过5 mL/min时，费菜总黄酮洗脱过快，单组分夹杂杂质。因此，选择洗脱速度为5 mL/min。
2.5 上样量的确定
由图3可知，样品上样量直接影响着层析收率。当费菜总黄酮粗提物上样量在2～10 g/kg时，总黄酮层析收率出现先升高再降低的趋势。当费菜总黄酮上样量为2 g/kg时，样品在解吸过程中分散较为严重，层析收率最低，仅为40.0%左右；随着总黄酮上样量的增加，层析收率有所提高，当达到5 g/kg时，层析收率达到最大值，为78.7%；当上样量再加大时，出现过载现象，费菜总黄酮单组分重叠，层析效果减弱，洗脱收率出现显著下降。因此，筛选出适宜上样量是保证最佳层析收率的基础，在保证分离度的情况下，上样量为5 g/kg时，层析收率最高。
2.6 结晶
由表2可知，丙酮、乙酸乙酯、异丙醇3种结晶溶剂对费菜总黄酮单组分精粉收率、纯度的影响差异较大，其中丙酮的结晶收率偏低，为57.6%，但其能去除部分杂质提高纯度，纯度高达95.1%。因此，综合考虑选用丙酮作为结晶溶剂。
3 结论
以费菜总黄酮粗提物为试材，采用聚合物纳米微球作为层析填料，对其进行层析纯化，结果发现，最优分离纯化方法是：选用聚合物纳米微球PS RPC-300作为最佳层析填料，70%乙醇作为洗脱剂分离纯化，洗脱速度为5 mL/min，上样量为5 g/kg填料，结晶溶剂为丙酮；在此优化条件下能够得到含量为95.1%的总黄酮，总收率为57.6%。该分离纯化方法简便可靠，不但简化了提取工艺，而且提高了成品收率，为费菜提取物的进一步研究提供参考。
参考文献
[1] 中国科学院中国植物志编委会.中国植物志 [M].北京：科学出版社，1984：72-74.
[2] 陈华珍，陈建伟.费菜不同器官中总黄酮的含量比较及其薄层鉴别[J].中医药学刊，2003，21（11）：1867，1917.
[3] 王耀辉，强毅，鲁秀兰，等.费菜不同部位原花色素含量分析[J].光谱实验室，2013，30（5）：2529-2534.
[4] 强毅，李江林，王晟昱，等.费菜不同部位氨基酸组成及含量分析[J].光谱实验室，2013，30（2）：1000-1003.
[5] 王鸿飞，刘飞，徐超，等.费菜总黄酮碱法提取工艺及抗氧化活性[J].农业工程学报，2012，28（S1）：317-321.
[6] 刘飞，王鸿飞，林燕，等.费菜总黄酮提取工艺的研究[J].食品工业科技，2011（4）：252-254，257.
[7] 林毅，张雪霞，李宁，等.聚合物纳米微球分离纯化达托霉素方法研究[J].中国抗生素杂志，2013，38（8）：588-591.