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【摘要】目的：探讨番茄叶醇提物的急性毒性及其对脂多糖（LPS）诱导急性炎症致氧化应激损伤大鼠的保护作用。方法：急性毒性试验是采用经口途径给予番茄叶醇提物，测定小鼠的半数致死量（LD50），并观察急性中毒表现。50只SD大鼠分为正常组、模型组与番茄叶醇提物654g/kg、327g/kg和218g/kg给药组，灌胃给药10 d。腹腔注射LPS复制急性炎症模型，以酶联免疫吸附剂法（ELISA）测定血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）和超敏C反应蛋白（Hs-CRP）水平。结果：番茄叶醇提物单次灌胃给药的LD50为6539g/kg。番茄叶醇提物可明显提高急性炎症大鼠血清SOD、GSHpx水平，并显著降低Hs-CRP水平。结论：番茄叶醇提物可拮抗LPS引起的急性炎症的氧化应激损伤。
【关键词】番茄叶醇提物；急性毒性试验；脂多糖；氧化应激损伤
【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）02-0052-02
Acute Toxicity and Protective Effects of Tomato Leaf Alcohol Extract against Oxidative Stress InjuryInduced by Acute Inflammatory
LU Honghao1WEI Zhiquan2YAN Li2*Qin Shichun2
1. Ruikang Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning 530012，China；2. Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning 53000，China
Abstract：In this research， acute toxicity of tomato leaf alcohol extract and protective effects of TLAE against oxidative stress injury induced by acute inflammatory were discussed. The oral lethal dosage （LD50） value of TLAE in mice is65.39g/kg obtained by using single dose acute toxicity testing for pharmaceuticals. Fifty SD rats were randomly divided into control group， model group and three TLAE treated groups of different dose （654，327，218g/kg）.Acute inflammation was induced byintraperitoneal injection oflipopolysaccharide （4mg/kg）.TLAEwere orallygiven once a day for 10 days. The levels of SOD， GSHpx in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.TLAE enhanced the levels of SOD，GSHpxand Lower thelevel of Hs-CRP in serum. These results suggested that the orally given TLAE can markedly restrainthe oxidative stress injury with the LPS-induced acute inflammatory.
Keywords： Alcohol Extract of Tomato Leaves； Acute Toxicity Test； Lipopolysaccharide； Oxidative Stress Injury
番茄葉為茄科多年生草本植物番茄Lycopersicon esculentum Mill的叶，具有特殊气味。对番茄叶进行的初步化学研究，发现其可能含有黄酮类、酚类、生物碱、挥发性成份、皂苷、有机酸等[1-3]。药理学研究发现，番茄茎叶粗提液对细菌具有较强的抑制作用，对霉菌的抑菌作用较弱，且叶粗提液的抑菌浓度高于茎粗提液[4]；番茄叶水提物可显著抑制LPS 诱导的大鼠急性炎症及其所致氧化应激[5-6]。番茄叶醇提取物不同极性部位的体外抗氧化试验表明，不同极性部位均有抗氧化作用[7]。但番茄叶醇提取物的体内抗氧化作用未见报道，因此，研究以LPS诱导急性炎症大鼠为研究对象，观察番茄叶醇提物对其血清Hs-CRP、SOD和GSHpx的影响，初步评估番茄叶醇提物的抗急性炎症氧化应激损伤的作用，并观察其对小鼠的急性毒性。
1仪器与材料
11实验动物SPF级昆明小鼠，体质量18～22g，雌雄各半，购自广西医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK桂2003-0003）。SPF级健康雄性SD大鼠50只，体重220～240g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（实验动物生产许可证号SCXK（湘）2009-0004）。
12药品的制备番茄叶采于广西百色国家农业科技园区无公害蔬菜产业化示范园。取干燥的番茄叶粉碎，加入乙醇浸泡后回流提取，过滤，减压回收乙醇，浓缩得到流浸膏（相当于原生药385g/mL），备用。
13试剂大肠杆菌脂多糖（美国Sigma公司，血清型O55：B5）；超敏C反应蛋白（Hs-CRP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）的ELISA试剂盒均为美国R&D公司产品。 14仪器MULTISKANGO酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
2方法
21急性经口毒性试验预试验结果显示，番茄叶醇提物的最大致死剂量为110g/kg，最小致死剂量为40g/kg。取小鼠60只，随机分为6组，给药剂量按如下方法确定：设定110g/kg为初始剂量，以1∶085为组距得到6个给药剂量，分别为1100、935、795、676、574、488g/kg。动物禁食不禁水12 h后灌胃给药，给药容积40mL/kg。给药后连续观察动物的行为14d，并记录死亡数，按改良寇氏法计算出半数致死量（LD50）。
22番茄叶醇提物对血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影响取LD50的1/10，1/20和1/30作为番茄叶醇提取物的高、中、低剂量（654g/kg，TLAE-H；327g/kg，TLAE-M；218g/kg，TLAE-L）。取大鼠50只随机分为正常组、模型组和番茄叶醇提取物高、中、低剂量给药组，每组10只。正常组和模型组给蒸馏水，各组动物均灌胃给药。9d后，腹腔注射LPS（4mg/kg）复制急性炎症动物模型。禁食不禁水12h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉穿刺取血，室温静置后于40℃离心（4000r/min，5min），分离血清，分装冻存于-20℃备测血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平。
采用Hs-CRP、SOD和GSHpx的ELISA检测试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。以CurveExpert曲线拟合软件计算标准曲线的直线回归方程，分别计算样品浓度。
23统计学处理所有计量资料均以均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，以SPSS 统计软件进行多个样本间均数比较，P<005表示差异具有统计学意义。
3结果
31急性经口毒性试验给药后小鼠出现自由活动减少，精神萎靡，身毛竖起，反应迟钝，静卧不动等症状，随着时间的推移，部分小鼠出现呼吸加快，兴奋躁动，步态不稳，抽搐等中毒症状，并出现死亡。存活小鼠则连续喂养观察14d，无动物死亡。结果见表1。按改良寇氏法计算，番茄叶醇提物单次灌胃给药的LD50为6539g/kg，其 95%可信限为571～749g/kg。
32番茄叶醇提物对血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影响腹腔注射LPS后，模型组大鼠血清Hs-CRP水平明显升高，SOD和GSHpx水平则明显降低，与正常组比较，其差异均有统计学意义（P<005）。与模型组比较，TLAE的3个给药组血清GSHpx水平及TLAE-H组、TLAE-M组的水平SOD均明显升高，Hs-CRP水平显著降低，其差异有统计学意义（P<005）。TLAE-L组血清SOD水平虽然高于模型组，但其差异均无统计学意义（P>005）。结果见表2。
4讨论
脂多糖（LPS）是革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，LPS进入人体后，激活单核巨噬细胞系统，促进大量的内源性细胞因子释放，激发机体的炎症反应，因此其被认为是造成全身性炎症综合征的主要原因。前期研究也证明，通过给动物腹膜注射一定剂量的LPS，可成功诱导急性炎症大鼠模型[5，8]。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。氧化应激和炎症紧密相连，抗氧化剂则可以减缓氧化应激带来的危害。
前期的研究发现，番茄叶水提物可显著抑制LPS 诱导的大鼠急性炎症及其所致氧化应激[5-6]，且番茄叶乙醇提取物不同极性部位在体外均有抗氧化作用[7]。研究结果显示，番茄叶醇提物可明显提高急性炎症小鼠血清SOD、GSHpx水平，并能显著降低Hs-CRP水平。提示番茄叶醇提物可拮抗LPS引起的急性炎症的氧化应激损伤。急性毒性试验结果表明，番茄叶醇提物单次灌胃给药的LD50为6539g/kg，其 95%可信限为571～749g/kg。
我国是一个农业大国，每年都将产生大量的农業废弃物，这些废弃物如果能得到有效利用，将成为宝贵的资源，如不经妥善处理进入环境，将会造成环境污染和生态恶化。中国是最主要的番茄及其副产品生产国之一，每年番茄成熟果实采摘后，番茄的茎叶都被废弃，没有被进行加工利用。对番茄叶进行抗氧化应激性研究，对如何利用番茄叶，减少其对环境污染，改善农村生态环境具有十分重要的意义，而且在世界能源日益枯竭的情况下，番茄叶作为一种资源，它的综合利用及其资源化方面的研究也将对农业与农村可持续发展产生重大影响。
参考文献
[1]潘雪峰， 杨明非， 袁锋. 番茄茎叶挥发物的气相色谱─质谱的定性分析[J].东北林业大学学报， 2000， 28（6）： 119-120.
[2]孙莹， 卢志平， 高松红， 等. 番茄茎叶挥发性成分的提取与鉴定[J].中国药物化学杂志， 2001， 11（5）： 277-278.
[3]梁臣艳， 邓家刚， 冯旭， 等.番茄叶化学成分的初步研究[J]. 中国民族民间医药， 2014， 42（17）： 26-28.
[4][JP3]常慧芳， 彭丹丹， 刘强.番茄茎叶粗提液活性成分抑菌作用的研究[J]. 廣州化工， 2014， 42（17）： 65-66. [JP]
[5]阎莉， 邓家刚， 卫智权. 番茄叶水提物急性毒性及其对急性炎症的影响[J]. 天然产物研究与开发， 2013， 25（6）：819-821.
[6]卫智权， 邓家刚， 阎莉. 番茄叶水提物对急性炎症氧化应激的拮抗作用[J].中国实验方剂学， 2015， 21（6）：131-134.
[7]杜成智， 王卉， 冯旭， 等. 番茄叶提取物不同极性部位的体外抗氧化作用[J].湖北农业科学， 2014， 53（4）：884-887.
[8]刘中原， 李延平. 细菌脂多糖的生物活性及作用机制[J].医学综述， 2014， 16（2）：166-169.
（编辑：梁志庆）
【关键词】番茄叶醇提物；急性毒性试验；脂多糖；氧化应激损伤
【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）02-0052-02
Acute Toxicity and Protective Effects of Tomato Leaf Alcohol Extract against Oxidative Stress InjuryInduced by Acute Inflammatory
LU Honghao1WEI Zhiquan2YAN Li2*Qin Shichun2
1. Ruikang Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning 530012，China；2. Guangxi Traditional Chinese Medical University， Nanning 53000，China
Abstract：In this research， acute toxicity of tomato leaf alcohol extract and protective effects of TLAE against oxidative stress injury induced by acute inflammatory were discussed. The oral lethal dosage （LD50） value of TLAE in mice is65.39g/kg obtained by using single dose acute toxicity testing for pharmaceuticals. Fifty SD rats were randomly divided into control group， model group and three TLAE treated groups of different dose （654，327，218g/kg）.Acute inflammation was induced byintraperitoneal injection oflipopolysaccharide （4mg/kg）.TLAEwere orallygiven once a day for 10 days. The levels of SOD， GSHpx in serum were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）.TLAE enhanced the levels of SOD，GSHpxand Lower thelevel of Hs-CRP in serum. These results suggested that the orally given TLAE can markedly restrainthe oxidative stress injury with the LPS-induced acute inflammatory.
Keywords： Alcohol Extract of Tomato Leaves； Acute Toxicity Test； Lipopolysaccharide； Oxidative Stress Injury
番茄葉為茄科多年生草本植物番茄Lycopersicon esculentum Mill的叶，具有特殊气味。对番茄叶进行的初步化学研究，发现其可能含有黄酮类、酚类、生物碱、挥发性成份、皂苷、有机酸等[1-3]。药理学研究发现，番茄茎叶粗提液对细菌具有较强的抑制作用，对霉菌的抑菌作用较弱，且叶粗提液的抑菌浓度高于茎粗提液[4]；番茄叶水提物可显著抑制LPS 诱导的大鼠急性炎症及其所致氧化应激[5-6]。番茄叶醇提取物不同极性部位的体外抗氧化试验表明，不同极性部位均有抗氧化作用[7]。但番茄叶醇提取物的体内抗氧化作用未见报道，因此，研究以LPS诱导急性炎症大鼠为研究对象，观察番茄叶醇提物对其血清Hs-CRP、SOD和GSHpx的影响，初步评估番茄叶醇提物的抗急性炎症氧化应激损伤的作用，并观察其对小鼠的急性毒性。
1仪器与材料
11实验动物SPF级昆明小鼠，体质量18～22g，雌雄各半，购自广西医科大学实验动物中心（生产许可证号：SCXK桂2003-0003）。SPF级健康雄性SD大鼠50只，体重220～240g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（实验动物生产许可证号SCXK（湘）2009-0004）。
12药品的制备番茄叶采于广西百色国家农业科技园区无公害蔬菜产业化示范园。取干燥的番茄叶粉碎，加入乙醇浸泡后回流提取，过滤，减压回收乙醇，浓缩得到流浸膏（相当于原生药385g/mL），备用。
13试剂大肠杆菌脂多糖（美国Sigma公司，血清型O55：B5）；超敏C反应蛋白（Hs-CRP）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）的ELISA试剂盒均为美国R&D公司产品。 14仪器MULTISKANGO酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
2方法
21急性经口毒性试验预试验结果显示，番茄叶醇提物的最大致死剂量为110g/kg，最小致死剂量为40g/kg。取小鼠60只，随机分为6组，给药剂量按如下方法确定：设定110g/kg为初始剂量，以1∶085为组距得到6个给药剂量，分别为1100、935、795、676、574、488g/kg。动物禁食不禁水12 h后灌胃给药，给药容积40mL/kg。给药后连续观察动物的行为14d，并记录死亡数，按改良寇氏法计算出半数致死量（LD50）。
22番茄叶醇提物对血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影响取LD50的1/10，1/20和1/30作为番茄叶醇提取物的高、中、低剂量（654g/kg，TLAE-H；327g/kg，TLAE-M；218g/kg，TLAE-L）。取大鼠50只随机分为正常组、模型组和番茄叶醇提取物高、中、低剂量给药组，每组10只。正常组和模型组给蒸馏水，各组动物均灌胃给药。9d后，腹腔注射LPS（4mg/kg）复制急性炎症动物模型。禁食不禁水12h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉穿刺取血，室温静置后于40℃离心（4000r/min，5min），分离血清，分装冻存于-20℃备测血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平。
采用Hs-CRP、SOD和GSHpx的ELISA检测试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。以CurveExpert曲线拟合软件计算标准曲线的直线回归方程，分别计算样品浓度。
23统计学处理所有计量资料均以均数加减标准差（x[TX-*3]±s）表示，以SPSS 统计软件进行多个样本间均数比较，P<005表示差异具有统计学意义。
3结果
31急性经口毒性试验给药后小鼠出现自由活动减少，精神萎靡，身毛竖起，反应迟钝，静卧不动等症状，随着时间的推移，部分小鼠出现呼吸加快，兴奋躁动，步态不稳，抽搐等中毒症状，并出现死亡。存活小鼠则连续喂养观察14d，无动物死亡。结果见表1。按改良寇氏法计算，番茄叶醇提物单次灌胃给药的LD50为6539g/kg，其 95%可信限为571～749g/kg。
32番茄叶醇提物对血清Hs-CRP、SOD和GSHpx水平的影响腹腔注射LPS后，模型组大鼠血清Hs-CRP水平明显升高，SOD和GSHpx水平则明显降低，与正常组比较，其差异均有统计学意义（P<005）。与模型组比较，TLAE的3个给药组血清GSHpx水平及TLAE-H组、TLAE-M组的水平SOD均明显升高，Hs-CRP水平显著降低，其差异有统计学意义（P<005）。TLAE-L组血清SOD水平虽然高于模型组，但其差异均无统计学意义（P>005）。结果见表2。
4讨论
脂多糖（LPS）是革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，LPS进入人体后，激活单核巨噬细胞系统，促进大量的内源性细胞因子释放，激发机体的炎症反应，因此其被认为是造成全身性炎症综合征的主要原因。前期研究也证明，通过给动物腹膜注射一定剂量的LPS，可成功诱导急性炎症大鼠模型[5，8]。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基和活性氮自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。氧化应激和炎症紧密相连，抗氧化剂则可以减缓氧化应激带来的危害。
前期的研究发现，番茄叶水提物可显著抑制LPS 诱导的大鼠急性炎症及其所致氧化应激[5-6]，且番茄叶乙醇提取物不同极性部位在体外均有抗氧化作用[7]。研究结果显示，番茄叶醇提物可明显提高急性炎症小鼠血清SOD、GSHpx水平，并能显著降低Hs-CRP水平。提示番茄叶醇提物可拮抗LPS引起的急性炎症的氧化应激损伤。急性毒性试验结果表明，番茄叶醇提物单次灌胃给药的LD50为6539g/kg，其 95%可信限为571～749g/kg。
我国是一个农业大国，每年都将产生大量的农業废弃物，这些废弃物如果能得到有效利用，将成为宝贵的资源，如不经妥善处理进入环境，将会造成环境污染和生态恶化。中国是最主要的番茄及其副产品生产国之一，每年番茄成熟果实采摘后，番茄的茎叶都被废弃，没有被进行加工利用。对番茄叶进行抗氧化应激性研究，对如何利用番茄叶，减少其对环境污染，改善农村生态环境具有十分重要的意义，而且在世界能源日益枯竭的情况下，番茄叶作为一种资源，它的综合利用及其资源化方面的研究也将对农业与农村可持续发展产生重大影响。
参考文献
[1]潘雪峰， 杨明非， 袁锋. 番茄茎叶挥发物的气相色谱─质谱的定性分析[J].东北林业大学学报， 2000， 28（6）： 119-120.
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[5]阎莉， 邓家刚， 卫智权. 番茄叶水提物急性毒性及其对急性炎症的影响[J]. 天然产物研究与开发， 2013， 25（6）：819-821.
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[7]杜成智， 王卉， 冯旭， 等. 番茄叶提取物不同极性部位的体外抗氧化作用[J].湖北农业科学， 2014， 53（4）：884-887.
[8]刘中原， 李延平. 细菌脂多糖的生物活性及作用机制[J].医学综述， 2014， 16（2）：166-169.
（编辑：梁志庆）