【摘 要】
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目的:构建含有蛋白降解基序PEST序列的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达载体pQCXIP-EGFP-PEST-N1,并检测其对蛋白稳定性的调节.方法:以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES为模板
【机 构】
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山西医科大学第二临床医学院,山西太原030001军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京,100071;首都医科大学附属北京世纪坛医院肿瘤内科,肿瘤治疗性疫苗
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目的:构建含有蛋白降解基序PEST序列的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因表达载体pQCXIP-EGFP-PEST-N1,并检测其对蛋白稳定性的调节.方法:以NFATx6-mPro-EGFP-PEST-YES为模板,PCR扩增EGFP-PEST序列,克隆入逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-N1构建pQCXIP-EGFP-PEST-N1,病毒包装后感染293FT细胞获得稳定细胞系;用蛋白酶体抑制剂MG-132处理细胞,Western印迹检测EGFP的表达变化.结果:构建获得逆转录病毒载体pQCXIP-EGFP-PEST-N1,感染293FT细胞后,与对照组相比,EGFP表达显著降低,并且该降低可被MG-132处理逆转.结论:构建了EGFP-PEST蛋白的表达载体,PEST可以介导EGFP蛋白发生蛋白酶体依赖的降解.为实现基因编辑效果的可视化筛选奠定了基础.
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