论文部分内容阅读
摘要：纳豆激酶是纳豆芽孢杆菌的重要代谢产物。为探究纳豆激酶的溶栓效果，以纳豆浸提液、纳豆激酶发酵液为供试材料，以鸡血块、人工血栓为供试反应底物，观察各反应物的溶栓效果。试验结果表明：纳豆激酶发酵液、纳豆浸提液有溶解人工血栓的作用；纳豆激酶发酵液和纳豆浸提液对鸡血块的溶解率分别为60%和52%。
关键词：纳豆芽孢杆菌；纳豆激酶发酵液；体外溶栓
中图分类号：S154.39 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）06-0010-02
纳豆原名豆豉，1754年由鉴真法师东渡弘法带到日本。纳豆激酶是一种具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶，是纳豆发酵过程中由纳豆芽孢杆菌分泌产生的[1-3]。与其他溶栓药物相比，纳豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、无任何毒副作用等优势[4]，被广泛用于心脑血管疾病的预防。近年来，东南亚民间盛传 “吃纳豆预防血栓”“吃纳豆能长寿”。纳豆在我国也逐渐受到人们的青睐。通过体外溶栓试验分析比较纳豆浸提液和纳豆芽孢杆菌发酵液的溶栓效果，旨在为纳豆激酶溶栓特性研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌种 自行筛选得到1株纳豆芽孢杆菌，保存于沈阳农业大学土地与环境学院微生物学实验室。
1.1.2 试剂药品 牛纤维蛋白原和凝血酶购自辽宁省药品检验所，其他药品均购自国药集团。液体培养基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。
1.1.3 人工血栓的制备 将10 mg牛纤维蛋白原溶于1 mL无菌生理盐水中，加入1 Bp凝血酶迅速混匀，37 ℃水浴静置10 min，凝固形成人工血栓。
1.1.4 纳豆浸提液的制备 取自制纳豆2粒于10 mL无菌生理盐水中，充分震荡，该溶液即为纳豆浸提液。
1.2 试验方法
1.2.1 浓缩发酵液的提取 采用多次冻融法，将纳豆芽孢杆菌发酵液在4 ℃，8 000 r/min下离心30 min，去除菌体；将上清液在-20 ℃冰箱中冷冻至完全固化，再在室温下自然解冻，解冻至约有70%液体融化时，保存液体于-20 ℃冰箱中。重复此步骤，最终获得的液体即为浓缩发酵液。
1.2.2 体外溶解人工血栓效果试验 将10 mL纳豆浸提液倒入装有制备好的人工血栓培养皿中，盖上培养皿盖，在37 ℃条件下孵育数小时；用10 mL无菌生理盐水做空白试验，观察两组人工血栓的溶解情况。
1.2.3 血块溶解率的计算 新鲜鸡血在空气中自然凝固后切成小块，30 ℃烘干至恒重。每组取血块2块，称重记为m0，分别放入10 mL纳豆浸提液、0.9%无菌生理盐水、纳豆激酶浓缩发酵液和液体培养基中，37 ℃水浴反应4 h，每30 min震荡1次。反应结束后用反应液冲洗血块，30 ℃烘干至恒重，称量反应后血块质量，计算血块溶解率。
2 结果与分析
2.1 体外溶解人工血栓
试验发现，浸泡在纳豆浸提液中的人工血栓体积明显减小，而浸泡在生理盐水中的人工血栓块体积几乎无变化，这说明纳豆浸提液中确实含有能够溶解血栓的有效成分，且效果较为显著。
将浓缩纳豆激酶发酵液倒入装有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育数小时，观察发现人工血栓几乎完全溶解。
2.2 体外溶解血块
不同溶液对鸡血块的溶解效果如表1所示。用多次冻融法得到的浓缩纳豆激酶发酵液的溶血块效果最为明显，可达到60%；纳豆浸提液的效果次之，可达到52%。这都远远大于两个空白组，说明纳豆芽孢杆菌所产的胞外溶解血栓的有效物质——纳豆激酶具有比较强的溶栓能力。
3 结论
1） 从体外溶解人工血栓的试验效果可以看出，纳豆浸提液与用多次冻融法提取的纳豆激酶发酵液均可以溶解人工血栓，且纳豆激酶发酵液溶解人工血栓的作用强于纳豆浸提液。
2） 从体外溶解血块的试验可以得出，纳豆激酶发酵液的溶血块效果较为明显，溶解率达到60%；纳豆浸提液的溶解率为52%，均远大于两个空白组。
3） 试验结果显示，浓缩发酵液对人工血栓和血块的溶解效果均大于纳豆浸提液，这说明纳豆芽孢杆菌产的溶解血栓的有效物质——纳豆激酶具有比较明显的溶解血栓能力，且浓度越大效果越强。
参考文献
[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.
[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.
[3] 朱健辉，杜连祥，路福平，等.高效溶栓酶——纳豆激酶的纯化及酶学性质研究[J].微生物学通报，2006，33（1）：68-71.
[4] 王刚，郭明珠，陈光.枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质[J].食品科学，2012，33（15）：231-234.
关键词：纳豆芽孢杆菌；纳豆激酶发酵液；体外溶栓
中图分类号：S154.39 文献标识码：A 文章编号：1674-1161（2014）06-0010-02
纳豆原名豆豉，1754年由鉴真法师东渡弘法带到日本。纳豆激酶是一种具有强烈溶栓作用的丝氨酸蛋白酶，是纳豆发酵过程中由纳豆芽孢杆菌分泌产生的[1-3]。与其他溶栓药物相比，纳豆激酶具有溶栓效果好、易于提取、成本低廉、无任何毒副作用等优势[4]，被广泛用于心脑血管疾病的预防。近年来，东南亚民间盛传 “吃纳豆预防血栓”“吃纳豆能长寿”。纳豆在我国也逐渐受到人们的青睐。通过体外溶栓试验分析比较纳豆浸提液和纳豆芽孢杆菌发酵液的溶栓效果，旨在为纳豆激酶溶栓特性研究提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
1.1.1 菌种 自行筛选得到1株纳豆芽孢杆菌，保存于沈阳农业大学土地与环境学院微生物学实验室。
1.1.2 试剂药品 牛纤维蛋白原和凝血酶购自辽宁省药品检验所，其他药品均购自国药集团。液体培养基：每升含葡萄糖20 g，大豆蛋白胨10 g，NaCl 2 g，酵母膏1 g。
1.1.3 人工血栓的制备 将10 mg牛纤维蛋白原溶于1 mL无菌生理盐水中，加入1 Bp凝血酶迅速混匀，37 ℃水浴静置10 min，凝固形成人工血栓。
1.1.4 纳豆浸提液的制备 取自制纳豆2粒于10 mL无菌生理盐水中，充分震荡，该溶液即为纳豆浸提液。
1.2 试验方法
1.2.1 浓缩发酵液的提取 采用多次冻融法，将纳豆芽孢杆菌发酵液在4 ℃，8 000 r/min下离心30 min，去除菌体；将上清液在-20 ℃冰箱中冷冻至完全固化，再在室温下自然解冻，解冻至约有70%液体融化时，保存液体于-20 ℃冰箱中。重复此步骤，最终获得的液体即为浓缩发酵液。
1.2.2 体外溶解人工血栓效果试验 将10 mL纳豆浸提液倒入装有制备好的人工血栓培养皿中，盖上培养皿盖，在37 ℃条件下孵育数小时；用10 mL无菌生理盐水做空白试验，观察两组人工血栓的溶解情况。
1.2.3 血块溶解率的计算 新鲜鸡血在空气中自然凝固后切成小块，30 ℃烘干至恒重。每组取血块2块，称重记为m0，分别放入10 mL纳豆浸提液、0.9%无菌生理盐水、纳豆激酶浓缩发酵液和液体培养基中，37 ℃水浴反应4 h，每30 min震荡1次。反应结束后用反应液冲洗血块，30 ℃烘干至恒重，称量反应后血块质量，计算血块溶解率。
2 结果与分析
2.1 体外溶解人工血栓
试验发现，浸泡在纳豆浸提液中的人工血栓体积明显减小，而浸泡在生理盐水中的人工血栓块体积几乎无变化，这说明纳豆浸提液中确实含有能够溶解血栓的有效成分，且效果较为显著。
将浓缩纳豆激酶发酵液倒入装有人工血栓的Ep管中，37 ℃孵育数小时，观察发现人工血栓几乎完全溶解。
2.2 体外溶解血块
不同溶液对鸡血块的溶解效果如表1所示。用多次冻融法得到的浓缩纳豆激酶发酵液的溶血块效果最为明显，可达到60%；纳豆浸提液的效果次之，可达到52%。这都远远大于两个空白组，说明纳豆芽孢杆菌所产的胞外溶解血栓的有效物质——纳豆激酶具有比较强的溶栓能力。
3 结论
1） 从体外溶解人工血栓的试验效果可以看出，纳豆浸提液与用多次冻融法提取的纳豆激酶发酵液均可以溶解人工血栓，且纳豆激酶发酵液溶解人工血栓的作用强于纳豆浸提液。
2） 从体外溶解血块的试验可以得出，纳豆激酶发酵液的溶血块效果较为明显，溶解率达到60%；纳豆浸提液的溶解率为52%，均远大于两个空白组。
3） 试验结果显示，浓缩发酵液对人工血栓和血块的溶解效果均大于纳豆浸提液，这说明纳豆芽孢杆菌产的溶解血栓的有效物质——纳豆激酶具有比较明显的溶解血栓能力，且浓度越大效果越强。
参考文献
[1] SUMI H，HAMADA H，TSUSHIMA H，et al.A novel fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto；a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Cellular and Molecular Life Sciences，1987，43（10）：1 110-1 111.
[2] FUJITA M，NOMURA K，HONG K， et al.Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme （nattokinase） in the vegetable cheese natto，a popular soybean fermented food in Japan[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，1993，197（3）：1 340-1 347.
[3] 朱健辉，杜连祥，路福平，等.高效溶栓酶——纳豆激酶的纯化及酶学性质研究[J].微生物学通报，2006，33（1）：68-71.
[4] 王刚，郭明珠，陈光.枯草芽孢杆菌纳豆激酶分离纯化及酶学性质[J].食品科学，2012，33（15）：231-234.