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【摘要】目的探讨秦皮乙素（Esc）对多柔比星（DOX）诱导的H9C2细胞损伤的保护作用及机制。方法培养H9C2心肌细胞并分为空白组、DOX组、Esc+DOX组，透射电镜观察各组细胞超微结构，蛋白免疫印迹法检测各组Bmi1的表达情况。将细胞重新分为3组：DOX组，空白siRNA转染组（Esc+DOX+NC siRNA）和Bmi1 siRNA转染组（Esc+DOX+Bmi1 siRNA），蛋白免疫印迹法检测各组Bmi1的表达情况，流式细胞术检测细胞凋亡情况和细胞内活性氧（ROS）的含量。结果DOX组细胞肿胀、线粒体嵴断裂，Bmi1表达低于Esc+DOX组（P<001）；Bmi1 siRNA转染组H9C2细胞凋亡数量、ROS含量高于空白siRNA组（P均<001），Bmi1表达低于空白siRNA转染组（P<001）。结论秦皮乙素可减轻多柔比星诱导H9C2细胞的凋亡，其作用机制可能与抑制Bmi1表达，从而调节线粒体功能及减少ROS的产生有关。
【关键词】多柔比星；秦皮乙素；线粒体；Bmi1
Molecular mechanism of the effect of esculetin on relieving doxorubicin toxicityLi Xiao， Xu Fan， Fang Liang，Zhang Shenglin， Jiang Haijun，Zhao BoAffiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，China
Corresponding author，Xu Fan，Email：28574060@qqcom
【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of esculetin （Esc） on doxorubicin（DOX）induced injury in H9C2 cells MethodsH9C2 myocardiac cells were cultured and divided into the control， DOX and Esc+DOX groups The ultrastructure of the cells in each group was observed by transmission electron microscope The expression of Bmi1 in each group was detected by western blot The cells were then divided into three groups： DOX， Esc+DOX+NC siRNA and Esc+DOX+Bmi1 siRNA groups Western blot was used to detect the expression of Bmi1 in each group The cellular apoptosis and the content of intracellular reactive oxygen species （ROS） were detected by flow cytometry ResultsIn the DOX group， cell swelling and mitochondrial cristae breakeage were observed and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX group （P<001） In the Esc+DOX+Bmi1 siRNA group， the quantity of apoptotic cells and the content of ROS were significantly higher than that in the Esc+DOX+NC siRNA group（both P<001）， and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX+NC siRNA group （P<001） ConclusionsEsc can mitigate the DOXinduced injury in the H9C2 cells The underlying mechanism is probably correlated with the downregulated expression level of Bmi1， thereby modulating the mitochondrial function and reducing the production of ROS
【Key words】Doxorubicin； Esculetin； Mitochondria； Bmi1
多柔比星為蒽环类抗生素，具有广谱抗肿瘤作用，但其对正常细胞（心脏、肝脏、肾脏等细胞）具有毒性作用，严重制约多柔比星的临床应用[1]。有研究表明，当多柔比星的累积总量大于600 mg/m2时，心力衰竭的发生率达36%[2]。多柔比星诱导心脏毒性的机制比较复杂，包括刺激自由基形成增加、线粒体损伤、细胞凋亡等，其对正常细胞的毒性主要为线粒体功能破坏、线粒体损伤[3]。秦皮乙素是中药秦皮的主要活性成分，可清除氧自由基、保护细胞免受过氧化物造成的损伤，之前已有研究证实Bmi1基因在DNA损伤应答、维持线粒体功能和活性氧（ROS）平衡过程中发挥重要的作用[4]。在本研究中我们首次探究了秦皮乙素对H9C2细胞内Bmi1表达的调节作用，以探讨秦皮乙素保护多柔比星致心肌细胞损伤的可能机制。 材料与方法
一、材料
大鼠胚胎心肌细胞H9C2，来源于中国科学院细胞库。RPMI1640培养基（货号：SH3080901B）和胎牛血清（FBS货号：SV3008703），购于HyClone Laboratories公司（美国）；GAPDH的一抗（兔多抗，货号：104941AP）、二抗（羊抗兔IgG HRP抗体，货号：104941AP）购于Proteintech公司（中国武汉）；Bmi1 siRNA（货号：6442S ）和NC siRNA（货号：abx918119 ）均来自生兴生物公司（中国南京）；DCFHDA（货号：D6470）购于Invitrogen公司（美国）；多柔比星（货号：ASD807）、秦皮乙素（货号：YMWS1229）购于阿拉丁生物化学技术有限公司（中国上海）。
二、细胞培养及分组
H9C2细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，当细胞覆盖培养瓶底部的80%时，使用胰蛋白酶消化以制备单细胞悬液。然后将H9C2细胞接种到96孔板，调整细胞浓度为5×104个/ml，细胞分为3组：空白组（Control）、多柔比星（DOX）组、秦皮乙素（Esc+DOX）组。空白组细胞只加培养基，秦皮乙素组细胞加入10 μmol/L秦皮乙素培养2 h[5]；然后在Dox和Esc+Dox组细胞加入8 μmol/L多柔比星继续培养48 h，收集细胞待用。
三、透射电子显徼镜观察线粒体结
收集各组细胞，加入25%戊二醛在4 ℃的冰箱中固定48 h；再用1%四氧化锇在4 ℃固定30 min；用系列丙酮在室温下脱水；然后用包埋剂包埋，用超薄切片机切片并染色，透射电子显微镜检测线粒体结构改变。
四、Bmi1在H9C2细胞中的表达及其对细胞损伤的影响
1通过胰蛋白酶消化收集各组细胞
使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶将细胞抗原按分子量大小分离，湿式转膜将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，分别加入Bmi1、GAPDH一抗（用一抗稀释液将一抗按照1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜，再分别加入二抗（用二抗稀释液将二抗按照1∶2 000稀释）室温下2 h，在暗室中将ECL发光液覆盖于膜表面，用化学发光荧光影像分析仪进行曝光，检测各组Bmi1的表达。
2实验细胞分组
将细胞重新分为3组：DOX组、空白siRNA转染组（Esc+DOX+NC siRNA）和Bmi1 siRNA转染组（Esc+DOX+Bmi1 siRNA）。將300 pmol Bmi1 siRNA和300 pmol空白siRNA加入到2 ml无血清OptiMEM I培养基中，将LipofectamineTM RNAiMAX加入（20 μl）至2种溶液中，然后充分混合并加入细胞中。孵育48 h后，通过蛋白免疫印迹法检测每组Bmi1的表达；然后用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；在每组细胞中加入10 μmol/L DCFHDA染色溶液，37℃避光孵育20 min，采用流式细胞仪检测各组细胞ROS的水平。
五、统计学处理
使用SPSS 190进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey法，P<005为差异具有统计学意义。
结果
一、秦皮乙素可减轻多柔比星诱导的H9C2细胞毒性线粒体功能紊乱
电镜结果显示，DOX组出现H9C2细胞肿胀，线粒体嵴发生破裂。在Esc+DOX组中，H9C2细胞保持正常完整的线粒体（图1）。
二、秦皮乙素对多柔比星诱导的H9C2细胞Bmi1表达和细胞损伤的影响
蛋白免疫印迹分析表明，与DOX组相比，Esc+DOX组内Bmi1表达增加（图2A）。在敲除Bmi1后，与空白siRNA组相比，Bmi1 siRNA组中的Bmi1蛋白表达降低（图2B），细胞凋亡率升高（图2C），ROS水平升高（图2D）。因此，秦皮乙素对多柔比星诱导的心肌细胞损伤的作用机制是上调Bmi1的表达。
讨论
多柔比星是抗肿瘤谱广、活性强、在国内外被广泛使用的抗肿瘤药物。但长期使用时，由于剂量累积作用，存在严重的毒副反应，尤其是骨髓与心脏的毒性，大大限制了多柔比星的应用。多柔比星产生心脏毒性的机制很多，包括线粒体功能紊乱、ROS水平增高等[6]。本研究结果表明多柔比星会使线粒体的形态发生改变，增加了H9C2细胞内
Bmi1基因是多梳基因家族PcG的重要成员之一，由多种转录抑制因子组成，以多蛋白复合体的形式调控靶基因的表达，在细胞的增殖能力、细胞周期及细胞凋亡等生命现象中发挥着重要作用[7]。近来研究显示，Bmi1也在多种恶性肿瘤异常表达，包括乳腺癌、宫颈癌和肺癌等，与肿瘤的生物学特性和患者的预后转归密切相关，被认为是一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点[8]。Bmi1通过调节与线粒体功能和ROS产生相关的基因表达来调节线粒体功能。研究显示Bmi1基因缺失的细胞线粒体功能遭到了破坏，ROS水平升高，说明Bmi1可以直接调节细胞内氧化压力[9]。
本研究表明，秦皮乙素可以抑制多柔比星导致的Bmi1表达减少，从而调节线粒体功能及减少ROS的产生，减轻多柔比星对心肌细胞的毒性。有研究表明，Bmi1是miRNA132的下游靶基因，过表达miRNA132之后，可抑制Bmi1 的表达[10]。秦皮乙素减轻多柔比星致心脏毒性的其他机制尚需深入探讨，但本研究可为相关临床研究提供实验依据。
参考文献
[1]Barry E， Alvarez JA， Scully RE，Miller TL， Lipshultz SE Anthracyclineinduced cardiotoxicity： course， pathophysiology， prevention and management Expert Opin Pharmacother，2007，8（8）：10391058 [2]Chen ZC，Chen LJ，Cheng JT Doxorubicininduced cardiac toxicity is mediated by lowering of peroxisome proliferatoractivated receptor delta expression in rats PPAR Res， 2013：456042
[3]Nakamura T， Ueda Y， Juan Y， Katsuda S，Takahashi H， Koh E Fasmediated apoptosis inadriamycininduced cardiomyopathy in rats：In vivo study Circulation，2000，102（5）： 572578
[4]Ismail IH，Andrin C，McDonald D，Hendzel MJ BMI1mediated histone ubiquitylation promotes DNA doublestrand break repair J Cell Biol，2010，191（1）：4560.
[5]李潇，徐繁，房亮，曹向宇，姜海军，肖旭秦皮乙素减低多柔比星诱导心脏毒性的研究承德医学院学报， 2018，36（1）：1114
[6]Yoshida M，Shiojima I，Ikeda H，Komuro I Chronic doxombicin cardiotoxicity is mediated by oxidative DNA damageATMp53apoptosis pathway and attenuated by pitavastatin through the inhibition of Racl activity.J Mol Cell Cardiol，2009， 47（5）：698705
[7]Wu CY， Kang HY， Yang WL， Wu J， Jeong YS， Wang J， Chan CH， Lee SW， Zhang X， Lamothe B， Campos AD， Darnay BG， Lin HK Critical role of monoubiquitination of histone H2AX protein in histone H2AX phosphorylation and DNA damage response J Biol Chem，2011， 286（35）： 3080630815
[8]Dong Q， Sharma S， Liu H， Chen L， Gu B， Sun X， Wang G HDAC inhibitors reverse acquired radio resistance of KYSE150R esophageal carcinoma cells by modulating Bmi1 expression Toxicol Lett， 2014， 224 （1）： 121129
[9]Liu J，Liu C，Chen J，Song S，Lee IH，Quijano C，Liu H， Keyvanfar K， Chen H， Cao LY， Ahn BH， Kumar NG， Rovira II， Xu XL， van Lohuizen M， Motoyama N， Deng CX， Finkel T.Bmil regulates mitochondrial function and the DNAdamage response pathwayNature，2009，459（7245）：387392.
[10]譚洁媚，李明毅，梁颖miRNA132通过靶向调控Bmi1表达影响鼻咽癌细胞对放射治疗敏感性新医学，2015，46（7）：428432
（收稿日期：20171206）
（本文编辑：杨江瑜）
【关键词】多柔比星；秦皮乙素；线粒体；Bmi1
Molecular mechanism of the effect of esculetin on relieving doxorubicin toxicityLi Xiao， Xu Fan， Fang Liang，Zhang Shenglin， Jiang Haijun，Zhao BoAffiliated Hospital of Chengde Medical College，Chengde 067000，China
Corresponding author，Xu Fan，Email：28574060@qqcom
【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of esculetin （Esc） on doxorubicin（DOX）induced injury in H9C2 cells MethodsH9C2 myocardiac cells were cultured and divided into the control， DOX and Esc+DOX groups The ultrastructure of the cells in each group was observed by transmission electron microscope The expression of Bmi1 in each group was detected by western blot The cells were then divided into three groups： DOX， Esc+DOX+NC siRNA and Esc+DOX+Bmi1 siRNA groups Western blot was used to detect the expression of Bmi1 in each group The cellular apoptosis and the content of intracellular reactive oxygen species （ROS） were detected by flow cytometry ResultsIn the DOX group， cell swelling and mitochondrial cristae breakeage were observed and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX group （P<001） In the Esc+DOX+Bmi1 siRNA group， the quantity of apoptotic cells and the content of ROS were significantly higher than that in the Esc+DOX+NC siRNA group（both P<001）， and the expression of Bmi1 was significantly lower than that in the Esc+DOX+NC siRNA group （P<001） ConclusionsEsc can mitigate the DOXinduced injury in the H9C2 cells The underlying mechanism is probably correlated with the downregulated expression level of Bmi1， thereby modulating the mitochondrial function and reducing the production of ROS
【Key words】Doxorubicin； Esculetin； Mitochondria； Bmi1
多柔比星為蒽环类抗生素，具有广谱抗肿瘤作用，但其对正常细胞（心脏、肝脏、肾脏等细胞）具有毒性作用，严重制约多柔比星的临床应用[1]。有研究表明，当多柔比星的累积总量大于600 mg/m2时，心力衰竭的发生率达36%[2]。多柔比星诱导心脏毒性的机制比较复杂，包括刺激自由基形成增加、线粒体损伤、细胞凋亡等，其对正常细胞的毒性主要为线粒体功能破坏、线粒体损伤[3]。秦皮乙素是中药秦皮的主要活性成分，可清除氧自由基、保护细胞免受过氧化物造成的损伤，之前已有研究证实Bmi1基因在DNA损伤应答、维持线粒体功能和活性氧（ROS）平衡过程中发挥重要的作用[4]。在本研究中我们首次探究了秦皮乙素对H9C2细胞内Bmi1表达的调节作用，以探讨秦皮乙素保护多柔比星致心肌细胞损伤的可能机制。 材料与方法
一、材料
大鼠胚胎心肌细胞H9C2，来源于中国科学院细胞库。RPMI1640培养基（货号：SH3080901B）和胎牛血清（FBS货号：SV3008703），购于HyClone Laboratories公司（美国）；GAPDH的一抗（兔多抗，货号：104941AP）、二抗（羊抗兔IgG HRP抗体，货号：104941AP）购于Proteintech公司（中国武汉）；Bmi1 siRNA（货号：6442S ）和NC siRNA（货号：abx918119 ）均来自生兴生物公司（中国南京）；DCFHDA（货号：D6470）购于Invitrogen公司（美国）；多柔比星（货号：ASD807）、秦皮乙素（货号：YMWS1229）购于阿拉丁生物化学技术有限公司（中国上海）。
二、细胞培养及分组
H9C2细胞用含有10% FBS的RPMI1640培养基于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，当细胞覆盖培养瓶底部的80%时，使用胰蛋白酶消化以制备单细胞悬液。然后将H9C2细胞接种到96孔板，调整细胞浓度为5×104个/ml，细胞分为3组：空白组（Control）、多柔比星（DOX）组、秦皮乙素（Esc+DOX）组。空白组细胞只加培养基，秦皮乙素组细胞加入10 μmol/L秦皮乙素培养2 h[5]；然后在Dox和Esc+Dox组细胞加入8 μmol/L多柔比星继续培养48 h，收集细胞待用。
三、透射电子显徼镜观察线粒体结
收集各组细胞，加入25%戊二醛在4 ℃的冰箱中固定48 h；再用1%四氧化锇在4 ℃固定30 min；用系列丙酮在室温下脱水；然后用包埋剂包埋，用超薄切片机切片并染色，透射电子显微镜检测线粒体结构改变。
四、Bmi1在H9C2细胞中的表达及其对细胞损伤的影响
1通过胰蛋白酶消化收集各组细胞
使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶将细胞抗原按分子量大小分离，湿式转膜将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，分别加入Bmi1、GAPDH一抗（用一抗稀释液将一抗按照1∶1 000稀释）4 ℃孵育过夜，再分别加入二抗（用二抗稀释液将二抗按照1∶2 000稀释）室温下2 h，在暗室中将ECL发光液覆盖于膜表面，用化学发光荧光影像分析仪进行曝光，检测各组Bmi1的表达。
2实验细胞分组
将细胞重新分为3组：DOX组、空白siRNA转染组（Esc+DOX+NC siRNA）和Bmi1 siRNA转染组（Esc+DOX+Bmi1 siRNA）。將300 pmol Bmi1 siRNA和300 pmol空白siRNA加入到2 ml无血清OptiMEM I培养基中，将LipofectamineTM RNAiMAX加入（20 μl）至2种溶液中，然后充分混合并加入细胞中。孵育48 h后，通过蛋白免疫印迹法检测每组Bmi1的表达；然后用流式细胞术检测各组细胞凋亡情况；在每组细胞中加入10 μmol/L DCFHDA染色溶液，37℃避光孵育20 min，采用流式细胞仪检测各组细胞ROS的水平。
五、统计学处理
使用SPSS 190进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey法，P<005为差异具有统计学意义。
结果
一、秦皮乙素可减轻多柔比星诱导的H9C2细胞毒性线粒体功能紊乱
电镜结果显示，DOX组出现H9C2细胞肿胀，线粒体嵴发生破裂。在Esc+DOX组中，H9C2细胞保持正常完整的线粒体（图1）。
二、秦皮乙素对多柔比星诱导的H9C2细胞Bmi1表达和细胞损伤的影响
蛋白免疫印迹分析表明，与DOX组相比，Esc+DOX组内Bmi1表达增加（图2A）。在敲除Bmi1后，与空白siRNA组相比，Bmi1 siRNA组中的Bmi1蛋白表达降低（图2B），细胞凋亡率升高（图2C），ROS水平升高（图2D）。因此，秦皮乙素对多柔比星诱导的心肌细胞损伤的作用机制是上调Bmi1的表达。
讨论
多柔比星是抗肿瘤谱广、活性强、在国内外被广泛使用的抗肿瘤药物。但长期使用时，由于剂量累积作用，存在严重的毒副反应，尤其是骨髓与心脏的毒性，大大限制了多柔比星的应用。多柔比星产生心脏毒性的机制很多，包括线粒体功能紊乱、ROS水平增高等[6]。本研究结果表明多柔比星会使线粒体的形态发生改变，增加了H9C2细胞内
Bmi1基因是多梳基因家族PcG的重要成员之一，由多种转录抑制因子组成，以多蛋白复合体的形式调控靶基因的表达，在细胞的增殖能力、细胞周期及细胞凋亡等生命现象中发挥着重要作用[7]。近来研究显示，Bmi1也在多种恶性肿瘤异常表达，包括乳腺癌、宫颈癌和肺癌等，与肿瘤的生物学特性和患者的预后转归密切相关，被认为是一种新的肿瘤标志物和潜在的治疗靶点[8]。Bmi1通过调节与线粒体功能和ROS产生相关的基因表达来调节线粒体功能。研究显示Bmi1基因缺失的细胞线粒体功能遭到了破坏，ROS水平升高，说明Bmi1可以直接调节细胞内氧化压力[9]。
本研究表明，秦皮乙素可以抑制多柔比星导致的Bmi1表达减少，从而调节线粒体功能及减少ROS的产生，减轻多柔比星对心肌细胞的毒性。有研究表明，Bmi1是miRNA132的下游靶基因，过表达miRNA132之后，可抑制Bmi1 的表达[10]。秦皮乙素减轻多柔比星致心脏毒性的其他机制尚需深入探讨，但本研究可为相关临床研究提供实验依据。
参考文献
[1]Barry E， Alvarez JA， Scully RE，Miller TL， Lipshultz SE Anthracyclineinduced cardiotoxicity： course， pathophysiology， prevention and management Expert Opin Pharmacother，2007，8（8）：10391058 [2]Chen ZC，Chen LJ，Cheng JT Doxorubicininduced cardiac toxicity is mediated by lowering of peroxisome proliferatoractivated receptor delta expression in rats PPAR Res， 2013：456042
[3]Nakamura T， Ueda Y， Juan Y， Katsuda S，Takahashi H， Koh E Fasmediated apoptosis inadriamycininduced cardiomyopathy in rats：In vivo study Circulation，2000，102（5）： 572578
[4]Ismail IH，Andrin C，McDonald D，Hendzel MJ BMI1mediated histone ubiquitylation promotes DNA doublestrand break repair J Cell Biol，2010，191（1）：4560.
[5]李潇，徐繁，房亮，曹向宇，姜海军，肖旭秦皮乙素减低多柔比星诱导心脏毒性的研究承德医学院学报， 2018，36（1）：1114
[6]Yoshida M，Shiojima I，Ikeda H，Komuro I Chronic doxombicin cardiotoxicity is mediated by oxidative DNA damageATMp53apoptosis pathway and attenuated by pitavastatin through the inhibition of Racl activity.J Mol Cell Cardiol，2009， 47（5）：698705
[7]Wu CY， Kang HY， Yang WL， Wu J， Jeong YS， Wang J， Chan CH， Lee SW， Zhang X， Lamothe B， Campos AD， Darnay BG， Lin HK Critical role of monoubiquitination of histone H2AX protein in histone H2AX phosphorylation and DNA damage response J Biol Chem，2011， 286（35）： 3080630815
[8]Dong Q， Sharma S， Liu H， Chen L， Gu B， Sun X， Wang G HDAC inhibitors reverse acquired radio resistance of KYSE150R esophageal carcinoma cells by modulating Bmi1 expression Toxicol Lett， 2014， 224 （1）： 121129
[9]Liu J，Liu C，Chen J，Song S，Lee IH，Quijano C，Liu H， Keyvanfar K， Chen H， Cao LY， Ahn BH， Kumar NG， Rovira II， Xu XL， van Lohuizen M， Motoyama N， Deng CX， Finkel T.Bmil regulates mitochondrial function and the DNAdamage response pathwayNature，2009，459（7245）：387392.
[10]譚洁媚，李明毅，梁颖miRNA132通过靶向调控Bmi1表达影响鼻咽癌细胞对放射治疗敏感性新医学，2015，46（7）：428432
（收稿日期：20171206）
（本文编辑：杨江瑜）