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摘要[目的]明确超敏蛋白对水稻立枯病的诱抗作用。[方法]以龙粳37水稻品种为试验材料，研究不同浓度超敏蛋白浸种处理对水稻生长发育的影响，测定超敏蛋白处理后水稻苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）含量变化。[结果]不同浓度超敏蛋白对水稻生长发育均有促进作用，且与对照相比不同浓度超敏蛋白处理水稻均不同程度地诱导了水稻防御酶PAL、POD和PPO活性，以稀释20倍的超敏蛋白诱导能力最强。[结论]研究结果为超敏蛋白抗病机理研究提供了理论依据。
关键词超敏蛋白；水稻立枯病；防御酶；抗病性
中图分类号S435.111文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）13-186-02
水稻立枯病是水稻旱育苗的主要病害，主要因低温多湿、土壤偏碱、温差大、播种量过大、光照不足、秧苗细弱等多种因素所致。近些年来，随着水稻种植面积的扩大，该病在旱育秧田中发生普遍，轻者成团发生，重者幼苗全部死亡，严重影响了水稻秧苗素质和水稻产量。种子处理是防治秧田立枯病的有效方法之一，但近年来部分病菌对杀菌剂已经产生抗药性，而药剂又会污染环境，同时也会对有益微生物产生威胁[1]。诱导剂具有诱导抗性的广泛性，通过诱导植物自身产生抗性从而有利于保护植物和土壤中的有益微生物[2]。
超敏蛋白是从梨火疫病菌（Erwinina amylovora）中分离出来的[3]。据报道，超敏蛋白对60种以上病害都具有不同程度的抗病作用[4-7]，对番茄叶霉病诱抗效果达70.10%，对辣椒病毒病诱抗效果最高达96.90%，对油菜菌核病的诱抗防效最高达73.69%，可减轻小麦蚜虫危害达84.9%，减轻二化螟对水稻危害43%左右。目前，关于超敏蛋白用于浸种处理对水稻病害的诱抗效果的研究鲜见报道。鉴于此，笔者以龙粳37为试验材料，探讨了超敏蛋白对水稻苗期病害的诱导抗性效果，以期为生产实践提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
供试品种：龙粳37。供试药剂：超敏蛋白，由黑龙江八一农垦大学食品学院郭德军老师提供。
供试病原菌：立枯丝核菌、镰刀菌，由黑龙江八一农垦大学植物免疫室分离。
1.2方法
1.2.1超敏蛋白浸种对水稻生长发育的影响。
将超敏蛋白设置为3个浓度梯度，分别为原液、稀释20倍、稀释40倍，同时设清水对照，共4个处理。称取100.0 g种子，分别用上述浓度超敏蛋白对水稻种子进行浸种处理7 d，数取100粒种子放于培养皿中，置于25 ℃生化培养箱内进行发芽试验，每个处理3次重复，测定超敏蛋白对水稻幼苗生长的影响。
1.2.2超敏蛋白的诱抗作用。
试验处理同“1.2.1”。浸种催芽后进行室内盆栽试验，盆栽用田径高压灭菌后，定量上述供试立枯病病原菌，在水稻生长3叶期时，调查各处理立枯病的发病率，并取样测定相关的酶活性。
1.2.2.1粗酶液的提取。
称取1.0 g样本，放入预冷的研钵中，加入2.00 mL 0.2 mol/L硼酸缓冲液和0.4 g石英砂，于冰浴中研磨成浆，将提取液转入离心管中，12 000 r/min、4 ℃离心20 min。上清液即为粗酶液，将其放入冰箱中冷冻保存，测定酶活性。
1.2.2.2PAL活性的测定。参照薛应龙[8]的方法测定。
在4.20 mL反应体系中加入5.00 mmol/L硼酸缓冲液（pH 8.8）3.00 mL、0.02 mmol/L苯丙氨酸1.00 mL、粗酶液0.20 mL，在30 ℃水浴中反应30 min，于冰浴中终止反应，以不加酶液为对照，在290 nm波长下测定吸光值。以每分钟OD290增加001为1个酶活单位U，酶的比活单位为U/（g·min FW）。
1.2.2.3POD活性的测定。
参照朱广廉[9]的方法测定。在3.00 mL反应系统中加入50.00 mmol/L磷酸缓冲液（pH 78）297 mL、20.00 mmol/L愈创木酚50 μL、粗酶液20 μL、加入40.00 mmol/L H2O2 20 μL启动反应，然后在17 ℃水浴中反应2 min，以不加酶液为对照，在470 nm波长下测定吸光值。以每分钟OD470增加0.01为1个酶活单位U，酶的比活单位为U/（g·min FW）。
1.2.2.4PPO活性的测定。
参照李靖等[10]的方法测定。在3.30 mL反应体系中加入50.00 mmol/L磷酸缓冲液（pH 78）3.00 mL、粗酶液100 μL，加入100.00 mmol/L的邻苯二酚20 μL启动反应，30 ℃水浴反应2 min，以不加酶液为对照，在398 nm波长下测定吸光值。以每分钟OD398增加0.01为1个酶活单位U，酶的比活单位为U/（g·min FW）。
2结果与分析
2.1超敏蛋白浸种对水稻幼苗生长的影响
由表1可见，超敏蛋白浸种对水稻幼苗生长有明显的促进作用，与对照相比，不同浓度处理下，根长增长了8.57%～20.00%；根条数增加了19.05%～26.19%；株高增长了16.31%～17.73%，为水稻壮苗提供了保障。
2.2超敏蛋白处理对水稻立枯病发病情况的影响
由表2 可见，超敏蛋白不同处理后，水稻立枯病的发病率明显降低，其中原液处理对立枯病的防治效果最好，稀释不同倍数后仍有一定的效果，发病率分别下降了20.23%、19.48%和1613%，表明超敏蛋白对水稻立枯病具有一定的诱导抗病性。
2.3超敏蛋白对PAL活性的影响
PAL是苯丙烷类代谢的关键酶，苯丙烷代谢途径酶类活性的增加和代谢产物含量的提高是植物对病原菌抵抗的普遍反应[11]。如图1所示，用超敏蛋白处理水稻，水稻秧苗中PAL活性与对照组相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍相对于对照PAL酶活性分别提高了26.79%、23.95%和10.87%，说明超敏蛋白可诱导水稻中PAL酶活性，且在原液处理后酶活性达到高峰。 2.4超敏蛋白对POD活性的影响
POD是植物体内存在的一种氧化还原酶类，参与酚类氧化及木质素前体物质的聚合，能够加速其代谢产物聚合为类木质素的反应进程，从而加固细胞壁，阻止病原菌的进一步扩展[11]。如图2所示，用超敏蛋白处理水稻，水稻秧苗中POD活性与对照组相比均有所提高，分别是对照的1.008、1.026和1.015倍，不同浓度之间差异不大，超敏蛋白稀释20倍对水稻POD酶活性的诱导效果最好。
2.5超敏蛋白对PPO活性的影响
PPO的主要功能是在有氧条件下将多酚类物质氧化成对病原菌毒性更强的醌。激活蛋白诱导处理后PPO活性的升高有利于酚类物质的积
累和醌的大量形成，增强对病原菌的抑制作用[11]。由图3可见，用超敏蛋白处理水稻，水稻秧苗中PPO活性与对照组相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍相对于对照PPO活性分别提高了60.00%、67.60%和63.27%，表明超敏蛋白稀释20倍对水稻幼苗PPO活性的诱导效果最好。
3结论
该研究表明，超敏蛋白浸种处理水稻种子可促进秧苗生长和根系发育，并能有效控制水稻立枯病的发生。超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍的发病率均明显低于对照组，发病率分别下降了20.00%、19.80%和16.40%。超敏蛋白处理可提高水稻幼苗中PAL、POD、PPO活性。其中超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍相对于对照PAL活性分别提高了26.79%、23.95%和10.87%，POD活性均有小幅度提升，PPO活性分别提高了60.00%、67.60%和63.27%。超敏蛋白处理水稻种子防治立枯病的作用可能源于其能够诱导水稻幼苗抗性相关的防御酶系活性增强有关。综合幼苗生长及防御酶系活性可见，超敏蛋白稀释20倍时最佳。
参考文献
[1]
张传清，周明国，朱国念.稻瘟病化学防治药剂的历史沿革与研究现状[J].农药学学报，2009，11（1）：72-80.
[2] 李莉，刘振蛟，郭晓莉，等.β-氨基丁酸诱导水稻抗稻瘟病与植株防御酶活性的变化[J].江苏农业科学，2011，39（2）：185-186.
[3] WEI Z M，LADY R J，ZUMOFF C H，et al.Harpin，elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinina amylovora[J].Science，1992，257：85-88.
[4] 吴永汉，叶利勇，陈小影，等.康壮素在黄瓜上的应用效果[J].安徽农业科学，2002，30（4）：596-597.
[5] 王正刚，高正良，周本国，等.康壮素（HarpinEa）对烟草生长发育及抗病虫能力的影响[J].安徽农业科学，1998（2）：162，169.
[6] 何运祥，邓定元，刘勇，等.3%康壮素微颗粒剂对辣椒病毒病的防治效果及增产作用[J].湖南农业科学，2002（3）：49.
[7] 段同钊.植物生化激活超敏蛋白微粒剂（康壮素）[J].中国植保导刊，2004，24（2）：34-35.
[8] 薛应龙.植物生理学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1995.
[9] 朱广廉. 植物生理学实验[M].北京：北京大学出版社，1990.
[10] 李靖，利容千，袁文静，等.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化[J].植物病理学报，1991，21（4）：277-282.
[11] 刘大伟，段玉玺，陈立杰，等.灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生化机制研究[J].华北农学报，2009，24（1）：165-168.
关键词超敏蛋白；水稻立枯病；防御酶；抗病性
中图分类号S435.111文献标识码 A文章编号 0517-6611（2016）13-186-02
水稻立枯病是水稻旱育苗的主要病害，主要因低温多湿、土壤偏碱、温差大、播种量过大、光照不足、秧苗细弱等多种因素所致。近些年来，随着水稻种植面积的扩大，该病在旱育秧田中发生普遍，轻者成团发生，重者幼苗全部死亡，严重影响了水稻秧苗素质和水稻产量。种子处理是防治秧田立枯病的有效方法之一，但近年来部分病菌对杀菌剂已经产生抗药性，而药剂又会污染环境，同时也会对有益微生物产生威胁[1]。诱导剂具有诱导抗性的广泛性，通过诱导植物自身产生抗性从而有利于保护植物和土壤中的有益微生物[2]。
超敏蛋白是从梨火疫病菌（Erwinina amylovora）中分离出来的[3]。据报道，超敏蛋白对60种以上病害都具有不同程度的抗病作用[4-7]，对番茄叶霉病诱抗效果达70.10%，对辣椒病毒病诱抗效果最高达96.90%，对油菜菌核病的诱抗防效最高达73.69%，可减轻小麦蚜虫危害达84.9%，减轻二化螟对水稻危害43%左右。目前，关于超敏蛋白用于浸种处理对水稻病害的诱抗效果的研究鲜见报道。鉴于此，笔者以龙粳37为试验材料，探讨了超敏蛋白对水稻苗期病害的诱导抗性效果，以期为生产实践提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
供试品种：龙粳37。供试药剂：超敏蛋白，由黑龙江八一农垦大学食品学院郭德军老师提供。
供试病原菌：立枯丝核菌、镰刀菌，由黑龙江八一农垦大学植物免疫室分离。
1.2方法
1.2.1超敏蛋白浸种对水稻生长发育的影响。
将超敏蛋白设置为3个浓度梯度，分别为原液、稀释20倍、稀释40倍，同时设清水对照，共4个处理。称取100.0 g种子，分别用上述浓度超敏蛋白对水稻种子进行浸种处理7 d，数取100粒种子放于培养皿中，置于25 ℃生化培养箱内进行发芽试验，每个处理3次重复，测定超敏蛋白对水稻幼苗生长的影响。
1.2.2超敏蛋白的诱抗作用。
试验处理同“1.2.1”。浸种催芽后进行室内盆栽试验，盆栽用田径高压灭菌后，定量上述供试立枯病病原菌，在水稻生长3叶期时，调查各处理立枯病的发病率，并取样测定相关的酶活性。
1.2.2.1粗酶液的提取。
称取1.0 g样本，放入预冷的研钵中，加入2.00 mL 0.2 mol/L硼酸缓冲液和0.4 g石英砂，于冰浴中研磨成浆，将提取液转入离心管中，12 000 r/min、4 ℃离心20 min。上清液即为粗酶液，将其放入冰箱中冷冻保存，测定酶活性。
1.2.2.2PAL活性的测定。参照薛应龙[8]的方法测定。
在4.20 mL反应体系中加入5.00 mmol/L硼酸缓冲液（pH 8.8）3.00 mL、0.02 mmol/L苯丙氨酸1.00 mL、粗酶液0.20 mL，在30 ℃水浴中反应30 min，于冰浴中终止反应，以不加酶液为对照，在290 nm波长下测定吸光值。以每分钟OD290增加001为1个酶活单位U，酶的比活单位为U/（g·min FW）。
1.2.2.3POD活性的测定。
参照朱广廉[9]的方法测定。在3.00 mL反应系统中加入50.00 mmol/L磷酸缓冲液（pH 78）297 mL、20.00 mmol/L愈创木酚50 μL、粗酶液20 μL、加入40.00 mmol/L H2O2 20 μL启动反应，然后在17 ℃水浴中反应2 min，以不加酶液为对照，在470 nm波长下测定吸光值。以每分钟OD470增加0.01为1个酶活单位U，酶的比活单位为U/（g·min FW）。
1.2.2.4PPO活性的测定。
参照李靖等[10]的方法测定。在3.30 mL反应体系中加入50.00 mmol/L磷酸缓冲液（pH 78）3.00 mL、粗酶液100 μL，加入100.00 mmol/L的邻苯二酚20 μL启动反应，30 ℃水浴反应2 min，以不加酶液为对照，在398 nm波长下测定吸光值。以每分钟OD398增加0.01为1个酶活单位U，酶的比活单位为U/（g·min FW）。
2结果与分析
2.1超敏蛋白浸种对水稻幼苗生长的影响
由表1可见，超敏蛋白浸种对水稻幼苗生长有明显的促进作用，与对照相比，不同浓度处理下，根长增长了8.57%～20.00%；根条数增加了19.05%～26.19%；株高增长了16.31%～17.73%，为水稻壮苗提供了保障。
2.2超敏蛋白处理对水稻立枯病发病情况的影响
由表2 可见，超敏蛋白不同处理后，水稻立枯病的发病率明显降低，其中原液处理对立枯病的防治效果最好，稀释不同倍数后仍有一定的效果，发病率分别下降了20.23%、19.48%和1613%，表明超敏蛋白对水稻立枯病具有一定的诱导抗病性。
2.3超敏蛋白对PAL活性的影响
PAL是苯丙烷类代谢的关键酶，苯丙烷代谢途径酶类活性的增加和代谢产物含量的提高是植物对病原菌抵抗的普遍反应[11]。如图1所示，用超敏蛋白处理水稻，水稻秧苗中PAL活性与对照组相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍相对于对照PAL酶活性分别提高了26.79%、23.95%和10.87%，说明超敏蛋白可诱导水稻中PAL酶活性，且在原液处理后酶活性达到高峰。 2.4超敏蛋白对POD活性的影响
POD是植物体内存在的一种氧化还原酶类，参与酚类氧化及木质素前体物质的聚合，能够加速其代谢产物聚合为类木质素的反应进程，从而加固细胞壁，阻止病原菌的进一步扩展[11]。如图2所示，用超敏蛋白处理水稻，水稻秧苗中POD活性与对照组相比均有所提高，分别是对照的1.008、1.026和1.015倍，不同浓度之间差异不大，超敏蛋白稀释20倍对水稻POD酶活性的诱导效果最好。
2.5超敏蛋白对PPO活性的影响
PPO的主要功能是在有氧条件下将多酚类物质氧化成对病原菌毒性更强的醌。激活蛋白诱导处理后PPO活性的升高有利于酚类物质的积
累和醌的大量形成，增强对病原菌的抑制作用[11]。由图3可见，用超敏蛋白处理水稻，水稻秧苗中PPO活性与对照组相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍相对于对照PPO活性分别提高了60.00%、67.60%和63.27%，表明超敏蛋白稀释20倍对水稻幼苗PPO活性的诱导效果最好。
3结论
该研究表明，超敏蛋白浸种处理水稻种子可促进秧苗生长和根系发育，并能有效控制水稻立枯病的发生。超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍的发病率均明显低于对照组，发病率分别下降了20.00%、19.80%和16.40%。超敏蛋白处理可提高水稻幼苗中PAL、POD、PPO活性。其中超敏蛋白原液、稀释20倍、稀释40倍相对于对照PAL活性分别提高了26.79%、23.95%和10.87%，POD活性均有小幅度提升，PPO活性分别提高了60.00%、67.60%和63.27%。超敏蛋白处理水稻种子防治立枯病的作用可能源于其能够诱导水稻幼苗抗性相关的防御酶系活性增强有关。综合幼苗生长及防御酶系活性可见，超敏蛋白稀释20倍时最佳。
参考文献
[1]
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[4] 吴永汉，叶利勇，陈小影，等.康壮素在黄瓜上的应用效果[J].安徽农业科学，2002，30（4）：596-597.
[5] 王正刚，高正良，周本国，等.康壮素（HarpinEa）对烟草生长发育及抗病虫能力的影响[J].安徽农业科学，1998（2）：162，169.
[6] 何运祥，邓定元，刘勇，等.3%康壮素微颗粒剂对辣椒病毒病的防治效果及增产作用[J].湖南农业科学，2002（3）：49.
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[8] 薛应龙.植物生理学实验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1995.
[9] 朱广廉. 植物生理学实验[M].北京：北京大学出版社，1990.
[10] 李靖，利容千，袁文静，等.黄瓜感染霜霉病菌叶片中一些酶活性的变化[J].植物病理学报，1991，21（4）：277-282.
[11] 刘大伟，段玉玺，陈立杰，等.灰皮支黑豆抗大豆胞囊线虫3号生理小种的生化机制研究[J].华北农学报，2009，24（1）：165-168.