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摘要 为提取、分离纯化灵芝多糖及探究灵芝多糖的结构，采用热水浸提法提取出灵芝粗多糖、醇沉法除去蛋白质、DEAE-52纤维素离子交换柱法和超纯水透析纯化得到灵芝纯多糖，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）对灵芝多糖的结构进行检测。结果表明，在δ 4.94、4.87和4.40为3个异头氢信号，说明该多糖是由3种单糖组成；δ 4.94和4.87归属为β构型的单糖，δ 4.40归属为α构型的单糖，表明该多糖是由2种β构型和1种α构型的单糖所组成。
关键词 灵芝多糖；提取；纯化；结构
中图分类号 O657.3；TS207.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）17-0255-01
Research on Extraction and Structure of Ganoderma Polysaccharide
WANG Jun
（Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation，Ministry of Education，College of Life Science，China West Normal University，Nanchong Sichuan 637009）
Abstract To extract，separate and purify Ganoderma polysaccharide and to explore its structure，this experiment used hot water extraction method to extract the Ganoderma polysaccharide，used alcohol sinking method to remove protein，and used DEAE-52 cellulose ion exchange column method to get polysaccharide purified，and used nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum（1H NMR）to identify the structure of Ganoderma polysaccharide.The results showed that the polysaccharides were composed of 3 kinds of monosaccharides，which were composed of 3 different hydrogen signals in δ 4.94，4.87 and 4.40.The δ 4.94 and 4.87 belonged to monosaccharides of β configuration，and δ 4.40 belonged to monosaccharides of α configuration，which meaned that the polysaccharides were composed of 1 monosaccharide of α configuration and 2 wemonosaccharides of β configuration.
Key words Ganoderma polysaccharide；extraction；purification；structure
藥用真菌是中草藥的重要组成部分，一些传统药用真菌如灵芝、虫草等，在中国传统医药中起着重要的作用，长期以来一直用于预防和治疗各种人类疾病[1]。药用真菌资源丰富，在我国的分布十分广泛，其科学研究也具有重要的意义[2]。
灵芝（Ganoderma Lucidum Karst）是一种名贵的中药真菌。灵芝多糖是从灵芝子实体中提取的一种化学成分，灵芝多糖是灵芝中的一种重要活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老和抗氧化等多种生物活性，目前已成为一大研究热点，具有广阔的开发利用前景[3-4]。本研究以灵芝子实体为材料，采用热水浸提法和 DEAE-52离子交换柱层析法分离纯化获得了灵芝纯多糖，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）对灵芝多糖的结构进行了检测，为灵芝多糖的提取和结构分析提供基本依据，也为之后研究灵芝多糖对免疫细胞的活性、免疫机制及相关分子生物学机制奠定了科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验所用的灵芝由西南野生动植物资源保护教育部重点实验室提供；无水乙醇（成都市联合化工试剂研究所）；氢氧化钠、氯化钠、浓盐酸、浓硫酸（成都市科龙化工试剂厂）；DEAE-52纤维素（上海源叶生物科技有限公司）；透析袋（7 kDa）（BioSharp生物科技公司）。
1.2 仪器与设备
台式离心机（5424R）Eppendorf（德国）；落地式大容量冷冻离心机（Lynx 6000）Thermo（美国）；旋转蒸发器（RE-6000）、循环水真空泵（SHZ-Ⅲ）（上海亚荣生化仪器厂）；超纯水仪（Spring-R40i ）（锐思捷科学仪器有限公司）；粉碎机（HX-500A）（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；电子天平（AR2130）[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；电热恒温水浴锅（WBK-3B）（广东环凯微生物科技有限公司）；恒温干燥箱（101-3Y）（杭州蓝天化验仪器厂）。
1.3 试验方法
1.3.1 热水浸提法提取灵芝粗多糖。称取灵芝子实体130 g，65 ℃烘箱烘干后，置于粉碎机内粉碎。将粉碎后的灵芝粉倒入烧杯中加入超纯水混匀，置于90 ℃恒温水浴锅内水浴加热6 h。蒸煮完成后将混合液10 000 r/min离心30 min，收集沉淀按上述步骤重复2次；收集上清液置于旋转蒸发仪中浓缩。 1.3.2 醇沉法除去蛋白质。以3∶1的比例加入无水乙醇和浓缩液，醇沉1～2 d，10 000 r/min离心20 min，收集醇沉物，置于65 ℃烘箱内烘干待用；收集上清液进行旋转浓缩，置于65 ℃烘箱内烘干，即为灵芝寡聚糖，用于后续试验。超纯水溶解烘干后的醇沉物，10 000 r/min离心20 min，收集上清液，得到灵芝粗多糖。
1.3.3 DEAE-52纤维素离子交换柱法纯化灵芝粗多糖。称取50 g纤维素，超纯水浸泡混匀，弃上清。0.5 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，超纯水洗涤至中性，0.5 mol/L HCl溶液浸泡12 h，超纯水洗涤至中性，0.5 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，超纯水洗涤至中性，即完成了纤维素的活化。将活化好的纤维素沿着玻璃棒轻轻地倒入层析柱内，使纤维素在柱内自然沉降，并用超纯水压柱待用。
沿管壁轻轻地旋转加入灵芝粗多糖稀释液，向层析柱中加入超纯水，并收集过柱液，直至多糖完全洗脱。收集完成后，将收集的过柱液进行旋转浓缩，超纯水透析48 h，以10 000 r/min离心20 min。取上清，置于65 ℃烘箱内烘干，即为灵芝纯多糖。并用0.5 mol/L NaCl溶液洗脱色素，再用超纯水过柱。将纤维素从层析柱中倒出，按照维素活化的步骤再次活化纖维素，重复上述步骤直至获得足够量的灵芝纯多糖。
1.3.4 1H NMR测定灵芝多糖结构。取灵芝纯多糖溶于D2O中，在工作频率为59.75 MHz的FT-NMR波中进行1H NMR测定。
2 结果与分析
1H NMR中化学位移（δ）是通过出现不同位置的1H核磁共振信号确定所含氢基团类型。由图1可知，在δ 4.94、4.87和4.40为3个异头氢信号，说明该多糖是由3种单糖组成。δ 4.94和4.87可归属为β构型的单糖，而δ 4.40可归属为α构型的单糖，表明该多糖是由2种β构型和1种α构型的单糖所组成的多糖。在δ 3.14～4.08为多个质子的多重吸收峰，是第2～6位碳上的氢信号峰。
3 结论
近年来，国内外对灵芝多糖的提取、纯化及结构分析和生物活性等方面进行了大量的研究。何晋浙等[5-6]从灵芝子实体中提取得到灵芝多糖，并结合UV-VIS、IR、GC-MS和NMR法对灵芝多糖的结构进行解析，得到该灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖，主要构型特征是以（1→3）β-D线性连接的骨架结构。Zeng Tao等[7]从灵芝中分离提取了灵芝多糖（GLPS），并研究了GLPS在肿瘤治疗中的作用机制。结果表明，GLPS通过免疫调节、抗血管生成和细胞毒性介导抗肿瘤作用，从而抑制肿瘤发生或肿瘤生长。张志军等[8]对灵芝多糖进行了体外抗氧化活性研究，结果表明，灵芝多糖具有抗氧化作用和清除自由基的能力，对免疫功能疾病具有很好的预防作用。
本研究采用热水提取法从灵芝子实体中提取多糖，采取醇沉的方法浸提濃缩液除去蛋白质，通过DEAE-52纤维素离子交换柱纯化多糖，并使用超纯水透析去除寡聚糖、氨基酸等小分子物质，最后得到质量良好的灵芝多糖，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）对灵芝多糖的结构进行检测，可以推测出该多糖是由3种单糖组成，并且是由2种β构型和1种α构型的单糖类型所组成。综上所述，本研究可以为灵芝多糖的提取纯化奠定理论基础，为灵芝多糖的结构解析提供科学依据。关于结合其他结构鉴定方法对灵芝多糖的结构特征分析还有待于进一步研究，对灵芝多糖的生物学活性及相关分子机制也有待于下一步探究。
4 参考文献
[1] 陶文沂.药食用真菌研究技术[M].北京：化学工业出版社，2007：1.
[2] 张静潮，李荣春.中国药用真菌研究概述[J].安徽农业科学，2014，42（18）：6118-6120.
[3] 吉清妹，潘孝忠，符传良，等.野生灵芝与栽培灵芝主要成分和功效的比较分析[J].热带农业科学，2015，35（12）：80-83.
[4] 向俊宇，徐安，夏懋，等.灵芝多糖的研究进展[J].药学实践杂志，2010，28（4）：241-244.
[5] 何晋浙，邵平，孟祥河，等.灵芝多糖的结构特征分析[J].分析化学，2010，38（3）：372-376.
[6] 何晋浙，邵平，倪慧东，等.灵芝多糖结构及其组成研究[J].光谱学与光谱分析，2010，30（1）：123-127.
[7] ZENG Tao，XU Xiuping，CHEN Zhangfeng，et al.Ganoderma lucidum po-lysaccharides：immunomodulation and potential anti-tumor activities[J].The American Journal of Chinese Medicine，2011，39（1）：15-27.
[8] 张志军，李淑芳，魏雪生，等.灵芝多糖体外抗氧化活性的研究[J].化学与生物工程，2011，28（3）：63-65.
关键词 灵芝多糖；提取；纯化；结构
中图分类号 O657.3；TS207.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）17-0255-01
Research on Extraction and Structure of Ganoderma Polysaccharide
WANG Jun
（Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation，Ministry of Education，College of Life Science，China West Normal University，Nanchong Sichuan 637009）
Abstract To extract，separate and purify Ganoderma polysaccharide and to explore its structure，this experiment used hot water extraction method to extract the Ganoderma polysaccharide，used alcohol sinking method to remove protein，and used DEAE-52 cellulose ion exchange column method to get polysaccharide purified，and used nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum（1H NMR）to identify the structure of Ganoderma polysaccharide.The results showed that the polysaccharides were composed of 3 kinds of monosaccharides，which were composed of 3 different hydrogen signals in δ 4.94，4.87 and 4.40.The δ 4.94 and 4.87 belonged to monosaccharides of β configuration，and δ 4.40 belonged to monosaccharides of α configuration，which meaned that the polysaccharides were composed of 1 monosaccharide of α configuration and 2 wemonosaccharides of β configuration.
Key words Ganoderma polysaccharide；extraction；purification；structure
藥用真菌是中草藥的重要组成部分，一些传统药用真菌如灵芝、虫草等，在中国传统医药中起着重要的作用，长期以来一直用于预防和治疗各种人类疾病[1]。药用真菌资源丰富，在我国的分布十分广泛，其科学研究也具有重要的意义[2]。
灵芝（Ganoderma Lucidum Karst）是一种名贵的中药真菌。灵芝多糖是从灵芝子实体中提取的一种化学成分，灵芝多糖是灵芝中的一种重要活性物质，具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老和抗氧化等多种生物活性，目前已成为一大研究热点，具有广阔的开发利用前景[3-4]。本研究以灵芝子实体为材料，采用热水浸提法和 DEAE-52离子交换柱层析法分离纯化获得了灵芝纯多糖，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）对灵芝多糖的结构进行了检测，为灵芝多糖的提取和结构分析提供基本依据，也为之后研究灵芝多糖对免疫细胞的活性、免疫机制及相关分子生物学机制奠定了科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验所用的灵芝由西南野生动植物资源保护教育部重点实验室提供；无水乙醇（成都市联合化工试剂研究所）；氢氧化钠、氯化钠、浓盐酸、浓硫酸（成都市科龙化工试剂厂）；DEAE-52纤维素（上海源叶生物科技有限公司）；透析袋（7 kDa）（BioSharp生物科技公司）。
1.2 仪器与设备
台式离心机（5424R）Eppendorf（德国）；落地式大容量冷冻离心机（Lynx 6000）Thermo（美国）；旋转蒸发器（RE-6000）、循环水真空泵（SHZ-Ⅲ）（上海亚荣生化仪器厂）；超纯水仪（Spring-R40i ）（锐思捷科学仪器有限公司）；粉碎机（HX-500A）（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；电子天平（AR2130）[奥豪斯仪器（上海）有限公司]；电热恒温水浴锅（WBK-3B）（广东环凯微生物科技有限公司）；恒温干燥箱（101-3Y）（杭州蓝天化验仪器厂）。
1.3 试验方法
1.3.1 热水浸提法提取灵芝粗多糖。称取灵芝子实体130 g，65 ℃烘箱烘干后，置于粉碎机内粉碎。将粉碎后的灵芝粉倒入烧杯中加入超纯水混匀，置于90 ℃恒温水浴锅内水浴加热6 h。蒸煮完成后将混合液10 000 r/min离心30 min，收集沉淀按上述步骤重复2次；收集上清液置于旋转蒸发仪中浓缩。 1.3.2 醇沉法除去蛋白质。以3∶1的比例加入无水乙醇和浓缩液，醇沉1～2 d，10 000 r/min离心20 min，收集醇沉物，置于65 ℃烘箱内烘干待用；收集上清液进行旋转浓缩，置于65 ℃烘箱内烘干，即为灵芝寡聚糖，用于后续试验。超纯水溶解烘干后的醇沉物，10 000 r/min离心20 min，收集上清液，得到灵芝粗多糖。
1.3.3 DEAE-52纤维素离子交换柱法纯化灵芝粗多糖。称取50 g纤维素，超纯水浸泡混匀，弃上清。0.5 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，超纯水洗涤至中性，0.5 mol/L HCl溶液浸泡12 h，超纯水洗涤至中性，0.5 mol/L NaOH溶液浸泡12 h，超纯水洗涤至中性，即完成了纤维素的活化。将活化好的纤维素沿着玻璃棒轻轻地倒入层析柱内，使纤维素在柱内自然沉降，并用超纯水压柱待用。
沿管壁轻轻地旋转加入灵芝粗多糖稀释液，向层析柱中加入超纯水，并收集过柱液，直至多糖完全洗脱。收集完成后，将收集的过柱液进行旋转浓缩，超纯水透析48 h，以10 000 r/min离心20 min。取上清，置于65 ℃烘箱内烘干，即为灵芝纯多糖。并用0.5 mol/L NaCl溶液洗脱色素，再用超纯水过柱。将纤维素从层析柱中倒出，按照维素活化的步骤再次活化纖维素，重复上述步骤直至获得足够量的灵芝纯多糖。
1.3.4 1H NMR测定灵芝多糖结构。取灵芝纯多糖溶于D2O中，在工作频率为59.75 MHz的FT-NMR波中进行1H NMR测定。
2 结果与分析
1H NMR中化学位移（δ）是通过出现不同位置的1H核磁共振信号确定所含氢基团类型。由图1可知，在δ 4.94、4.87和4.40为3个异头氢信号，说明该多糖是由3种单糖组成。δ 4.94和4.87可归属为β构型的单糖，而δ 4.40可归属为α构型的单糖，表明该多糖是由2种β构型和1种α构型的单糖所组成的多糖。在δ 3.14～4.08为多个质子的多重吸收峰，是第2～6位碳上的氢信号峰。
3 结论
近年来，国内外对灵芝多糖的提取、纯化及结构分析和生物活性等方面进行了大量的研究。何晋浙等[5-6]从灵芝子实体中提取得到灵芝多糖，并结合UV-VIS、IR、GC-MS和NMR法对灵芝多糖的结构进行解析，得到该灵芝多糖的主要单糖组分为葡萄糖，主要构型特征是以（1→3）β-D线性连接的骨架结构。Zeng Tao等[7]从灵芝中分离提取了灵芝多糖（GLPS），并研究了GLPS在肿瘤治疗中的作用机制。结果表明，GLPS通过免疫调节、抗血管生成和细胞毒性介导抗肿瘤作用，从而抑制肿瘤发生或肿瘤生长。张志军等[8]对灵芝多糖进行了体外抗氧化活性研究，结果表明，灵芝多糖具有抗氧化作用和清除自由基的能力，对免疫功能疾病具有很好的预防作用。
本研究采用热水提取法从灵芝子实体中提取多糖，采取醇沉的方法浸提濃缩液除去蛋白质，通过DEAE-52纤维素离子交换柱纯化多糖，并使用超纯水透析去除寡聚糖、氨基酸等小分子物质，最后得到质量良好的灵芝多糖，并利用核磁共振氢谱（1H NMR）对灵芝多糖的结构进行检测，可以推测出该多糖是由3种单糖组成，并且是由2种β构型和1种α构型的单糖类型所组成。综上所述，本研究可以为灵芝多糖的提取纯化奠定理论基础，为灵芝多糖的结构解析提供科学依据。关于结合其他结构鉴定方法对灵芝多糖的结构特征分析还有待于进一步研究，对灵芝多糖的生物学活性及相关分子机制也有待于下一步探究。
4 参考文献
[1] 陶文沂.药食用真菌研究技术[M].北京：化学工业出版社，2007：1.
[2] 张静潮，李荣春.中国药用真菌研究概述[J].安徽农业科学，2014，42（18）：6118-6120.
[3] 吉清妹，潘孝忠，符传良，等.野生灵芝与栽培灵芝主要成分和功效的比较分析[J].热带农业科学，2015，35（12）：80-83.
[4] 向俊宇，徐安，夏懋，等.灵芝多糖的研究进展[J].药学实践杂志，2010，28（4）：241-244.
[5] 何晋浙，邵平，孟祥河，等.灵芝多糖的结构特征分析[J].分析化学，2010，38（3）：372-376.
[6] 何晋浙，邵平，倪慧东，等.灵芝多糖结构及其组成研究[J].光谱学与光谱分析，2010，30（1）：123-127.
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[8] 张志军，李淑芳，魏雪生，等.灵芝多糖体外抗氧化活性的研究[J].化学与生物工程，2011，28（3）：63-65.