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摘 要：利用正交试验设计优化藤茶果实中二氢杨梅素的提取工艺。以甲醇为溶剂，利用索式提取的方法提取藤茶果实和种子中的二氢杨梅素;在此基础上，以甲醇体积、提取温度和提取时间为因素，采用等水平正交表L9（34）设计三因素三水平试验。结果表明：藤茶果实中二氢杨梅素的含量显著高于藤茶种子;二氢杨梅素提取的最佳工艺条件为1 g藤茶样本，甲醇用量150 mL，提取温度85℃，提取时间4 h，该条件下藤茶果实中二氢杨梅素含量为44.77 mg·g-1。藤茶果实二氢杨梅素含量高于藤茶籽，更适于作为二氢杨梅素提取的材料;甲醇提取较之乙醇，更有利于藤茶果实中二氢杨梅素的提取，而温度是决定提取率的最主要因素。
关键词：藤茶; 二氢杨梅素; 正交试验
Abstract： The orthogonal experimental design was used to optimize the extraction technology of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata fruits. With the methanol as solvent， the dihydromyricetin was extracted from the fruits and seeds of Ampelopsis grossedentata by using the method of soxhlet extraction. On this basis， the volume of methanol， extraction temperature and extraction time were taken as factors to design the three-factor and three-level orthogonal experiment L9（34）. The results showed that the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruits was significantly higher than that in Ampelopsis grossedentata seeds. The optimal technological conditions for the extraction of dihydromyricetin were as follows： 1 g Ampelopsis grossedentata as the sample， 150 mL methanol， 85℃ extraction temperature， 4 h extraction time， and the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruit was 44.77 mg·g-1 under these conditions. As the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruit was higher than that in Ampelopsis grossedentata seed， Ampelopsis grossedentata fruit was more suitable material for the extraction of dihydromyricetin. Compared with ethanol， the extraction by methanol was more beneficial to the extraction of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata fruits， and the temperature was the main factor determining the extraction rate.
Key words： Ampelopsis grossedentata; Dihydromyricetin; Orthogonal experimental
藤茶Amepelopsis grossedentata，又名显齿蛇葡萄，是葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物，是一种非常古老的中草药资源、类茶植物资源和药食两用植物资源。二氢杨梅素是藤茶的主要活性成分，具有抗氧化、保肝护肝、消炎、止咳、降血糖、降血脂、增强免疫和抗肿瘤[1]等多种生理药理活性。
目前藤茶二氢杨梅素的提取和制备主要采用藤茶幼嫩茎叶为原料[2-4]，而有关藤茶果实二氢杨梅素的提取和制备方面的研究鲜见报道。本试验以藤茶果实为原料，以二氢杨梅素含量为指标，通过正交试验设计优化溶剂体积、提取温度和提取时间，确定藤茶果实中二氢杨梅素的最佳提取条件，以期进一步促进藤茶果实的开发与利用。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
1.1.1 仪器 酶标仪、电子天平、索氏提取器、96孔细胞培养板、干燥箱、DFY500粉碎机（江阴市新友机械制造有限公司）、恒温水浴锅、移液枪。
1.1.2 材料 试验用藤茶果实于2018年10月4日采摘于来凤县大河镇。甲醇、乙醇、二氢杨梅素标准品（98%，HPLC）购于上海同田生物科技有限公司。
1.2 试验方法
李雁云等：藤茶果实中二氢杨梅素的提取工艺研究2019年第5期
2019年第5期李雁云等：藤茶果实中二氫杨梅素的提取工艺研究
1.2.1 原料处理 藤茶果实采摘于恩施市来凤县大河镇两河口，洗净后，分为两部分。其中1份剥皮、留籽，将籽洗净、平铺晾干至恒重，而后置于粉碎机中粉碎成粉末，放于容器中贴好标签备用。另1份藤茶果实直接晾干至恒重，粉碎，备用。 1.2.2 测定波长的确定 称取少量二氢杨梅素纯品，溶解取样置于96孔板中，于酶标仪中扫描测定得扫描图谱，根据扫描图谱确定二氢杨梅素的最大吸收波长。
1.2.3 试验材料的确定 各称取1.0000 g藤茶果实粉末和藤茶籽粉末，分别用150 mL甲醇和150 mL乙醇、在80℃的条件下用索氏提取抽提4 h，取样置于酶标仪测量。利用OriginPro 8.0软件进行数据作图分析，确定试验材料。
1.2.4 索氏提取 用电子天平称取1.0000 g样本粉末，用滤纸包成圆柱形，放入索氏提取器内，在烧瓶里加入甲醇，水浴加热回流提取，自然冷却，用倾泻法将烧瓶中的提取液转移到烧杯中，用少量甲醇洗涤烧瓶2～3次，合并提取液，定容至250 mL容量瓶。
1.2.5 正交試验设计 以二氢杨梅素的含量为指标，对影响二氢杨梅素含量的甲醇用量（100、150、200 mL）、提取温度（75℃、80℃、85℃）、提取时间（4、6、8 h）3个因素进行L9（34）等水平正交试验设计，确定最佳提取条件。
1.3 含量测定
1.3.1 二氢杨梅素标准曲线的制备 称取适量二氢杨梅素纯品，制得浓度梯度为2、4、6、8、10 μg·mL-1的标准液，并依次于酶标仪中测量。求得291 nm处吸光度，以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2 藤茶果实中二氢杨梅素含量测定 采用紫外分光光度法测定藤茶中二氢杨梅素的含量[5]。称取1.000 g藤茶果实粉末，索氏提取后，将容量瓶中的提取液用200 μL移液枪移至96孔板中，移4～6个置于酶标仪中，测量291 nm下的吸光度，取其平均值，然后在二氢杨梅素标准曲线上查出相应含量。
1.4 数据处理
利用OriginPro 8.0软件进行数据分析，采用SPSS 20.0进行正交试验数据的方差分析。
2 结果与分析
2.1 二氢杨梅素的扫描吸收光谱
结合扫描吸收光谱与相关文献报道，确定最大吸收峰为291 nm，故采用291 nm作为二氢杨梅素浓度测定的波长（图1）。
2.2 溶剂及果实部位对二氢杨梅素提取量的影响
藤茶果实中的二氢杨梅素显著高于藤茶种子;且藤茶果实的甲醇提取物中二氢杨梅素含量显著高于乙醇提取物（图2）。故采用甲醇作为藤茶果实中二氢杨梅素的抽提试剂。
2.3 二氢杨梅素标准曲线
以二氢杨梅素浓度为横坐标，291 nm吸光度值为纵坐标，绘制散点图（图3），通过非线性回归分析，建立回归方程为：y =-0.04114+0.03626×e0.2039x，R=0.93719;回归方程极显著。
2.4 正交试验结果
正交试验结果表明，3个因素对藤茶果实二氢杨梅素提取影响程度大小依次为温度、甲醇用量、时间，各因素最优水平组合为A2B3C2（表1）。
方差分析表明（表2），在显著性水平α=0.10时，甲醇用量A和时间C两因素的各水平间差异不显著（P>0.10）;而温度B各水平间差异显著（P<0.10）。综合表1～2结果，得到最佳可行提取工艺组合为A2B3C1，即温度85℃、甲醇用量150 mL、时间4 h，此提取条件下的OD值为2.84。
2.5 验证试验结果
将最适条件下提取液分别稀释0、5、10、20倍，测得其吸光度值分别为2.7955、0.4999、0.3356、0.1839。其中，稀释20倍的样本吸光数值处在二氢杨梅素标准曲线取值范围内，因此将数 据0.1839代入回归方程 中，求得x=8.95 μg·mL-1，在该条件下藤茶果实中二氢杨梅素提取量为179.06 μg·mL-1，换算得出藤茶果实中二氢杨梅素含量44.77 mg·g-1。
3 讨论与结论
目前，有关用藤茶提取二氢杨梅素的提取工艺已有大量研究报道[6-9]，但大多均是以藤茶幼嫩茎叶为材料进行提取，围绕藤茶果实及种子的二氢杨梅素提取工艺鲜见报道。
研究表明，湖南省张家界藤茶果实中二氢杨梅素含量为6.255%，而叶片中二氢杨梅素含量为13.3%～25.5%[10]，果实中二氢杨梅素含量显著低于叶片中二氢杨梅素含量。其他研究表明产自湖南郴州、湖南湘潭和福建武夷山的藤茶（存放1年）叶片、花和叶柄中二氢杨梅素含量分别为3.83～3.99 mg·g-1、1.29～1.44 mg·g-1和0.98～1.04 mg·g-1;采用晒干方式加工藤茶的二氢杨梅素平均含量为4.72 mg·g-1，是采用热风烘干方式的1.2倍;且不同存放时间藤茶二氢杨梅素含量由高到低为存放2年、存放1年、存放3年，存放2年的藤茶二氢杨梅素含量平均含量达到14.42 mg·g-1，是存放3年的13.87倍[3]。可以看出不同产地、不同器官、不同加工方法，甚至不同存放时间对藤茶中二氢杨梅素的含量均有较大影响。
本试验显示影响藤茶果实二氢杨梅素提取效果的因素中，温度>甲醇用量>时间，这一结果与藤茶干燥茎叶基于索氏提取的文献报道一致[11-12]。试验测得藤茶果实索氏提取法最佳提取条件为温度85℃，甲醇用量150 mL，时间4 h;在此条件下，藤茶果实中二氢杨梅素含量为44.77 mg·g-1。该试验结果可为藤茶果实的开发与利用奠定基础。
参考文献：
[1]周防震，郑小江.中国良种—藤茶[M].武汉：湖北科学技术出版社，2016：1.
[2]雷燕妮，张小斌，李多伟.显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素超声提取工艺的优化[J].贵州农业科学，2018，46（5）：123-126.
[3]杨志坚，温杭凯，陈选阳，等.藤茶总黄酮和二氢杨梅素含量研究[J].福建农业科技，2017（10）：6-9.
[4]陈玉琼，李安琪，孟燕.藤茶黄酮及二氢杨梅素提取条件的优化[J].华中农业大学学报，2009，28（1）：106-110.
[5]刘建兰，于华忠，高梦，等.藤茶总黄酮和二氢杨梅素的提取检测研究进展[J].广东农业科学，2013，40（19）： 90-93.
[6]陈雁梅，于华忠，刘同方，等.酶法提取藤茶茎中二氢杨梅素工艺研究[J].应用化工，2016，45（2）：304-307.
[7]熊伟，王慧宾，李雄辉，等.热水浸提法同步提取藤茶中二氢杨梅素和多糖的工艺研究[J].生物化工，2015（1）：5-6，11.
[8]刘畅，邓薇，刘小英，等.藤茶生物活性成分及其制备工艺研究进展[J].食品工业，2015，36（4）：233-237.
[9]郑琳，龚自明.破壁式方法提取藤茶中二氢杨梅素的工艺研究[J].湖北农业科学，2018，57（22）：118-119，121.
[10]周耀，丰来，周政.藤茶植株叶果与组培物中二氢杨梅素含量的比较研究[J].湖南农业科学，2012，7（13）：105-107.
[11]熊璞，姚茂君，肖凯军.藤茶中二氢杨梅素的提取工艺研究[J].现代食品科技，2009，25（8）：907-910.
[12]涂招秀，熊伟，胡居吾，等.藤茶中二氢杨梅素的提取纯化工艺研究[J].江西食品工业，2011（2）：33-36.
（责任编辑：柯文辉）
关键词：藤茶; 二氢杨梅素; 正交试验
Abstract： The orthogonal experimental design was used to optimize the extraction technology of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata fruits. With the methanol as solvent， the dihydromyricetin was extracted from the fruits and seeds of Ampelopsis grossedentata by using the method of soxhlet extraction. On this basis， the volume of methanol， extraction temperature and extraction time were taken as factors to design the three-factor and three-level orthogonal experiment L9（34）. The results showed that the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruits was significantly higher than that in Ampelopsis grossedentata seeds. The optimal technological conditions for the extraction of dihydromyricetin were as follows： 1 g Ampelopsis grossedentata as the sample， 150 mL methanol， 85℃ extraction temperature， 4 h extraction time， and the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruit was 44.77 mg·g-1 under these conditions. As the content of dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata fruit was higher than that in Ampelopsis grossedentata seed， Ampelopsis grossedentata fruit was more suitable material for the extraction of dihydromyricetin. Compared with ethanol， the extraction by methanol was more beneficial to the extraction of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata fruits， and the temperature was the main factor determining the extraction rate.
Key words： Ampelopsis grossedentata; Dihydromyricetin; Orthogonal experimental
藤茶Amepelopsis grossedentata，又名显齿蛇葡萄，是葡萄科蛇葡萄属的一种野生藤本植物，是一种非常古老的中草药资源、类茶植物资源和药食两用植物资源。二氢杨梅素是藤茶的主要活性成分，具有抗氧化、保肝护肝、消炎、止咳、降血糖、降血脂、增强免疫和抗肿瘤[1]等多种生理药理活性。
目前藤茶二氢杨梅素的提取和制备主要采用藤茶幼嫩茎叶为原料[2-4]，而有关藤茶果实二氢杨梅素的提取和制备方面的研究鲜见报道。本试验以藤茶果实为原料，以二氢杨梅素含量为指标，通过正交试验设计优化溶剂体积、提取温度和提取时间，确定藤茶果实中二氢杨梅素的最佳提取条件，以期进一步促进藤茶果实的开发与利用。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
1.1.1 仪器 酶标仪、电子天平、索氏提取器、96孔细胞培养板、干燥箱、DFY500粉碎机（江阴市新友机械制造有限公司）、恒温水浴锅、移液枪。
1.1.2 材料 试验用藤茶果实于2018年10月4日采摘于来凤县大河镇。甲醇、乙醇、二氢杨梅素标准品（98%，HPLC）购于上海同田生物科技有限公司。
1.2 试验方法
李雁云等：藤茶果实中二氢杨梅素的提取工艺研究2019年第5期
2019年第5期李雁云等：藤茶果实中二氫杨梅素的提取工艺研究
1.2.1 原料处理 藤茶果实采摘于恩施市来凤县大河镇两河口，洗净后，分为两部分。其中1份剥皮、留籽，将籽洗净、平铺晾干至恒重，而后置于粉碎机中粉碎成粉末，放于容器中贴好标签备用。另1份藤茶果实直接晾干至恒重，粉碎，备用。 1.2.2 测定波长的确定 称取少量二氢杨梅素纯品，溶解取样置于96孔板中，于酶标仪中扫描测定得扫描图谱，根据扫描图谱确定二氢杨梅素的最大吸收波长。
1.2.3 试验材料的确定 各称取1.0000 g藤茶果实粉末和藤茶籽粉末，分别用150 mL甲醇和150 mL乙醇、在80℃的条件下用索氏提取抽提4 h，取样置于酶标仪测量。利用OriginPro 8.0软件进行数据作图分析，确定试验材料。
1.2.4 索氏提取 用电子天平称取1.0000 g样本粉末，用滤纸包成圆柱形，放入索氏提取器内，在烧瓶里加入甲醇，水浴加热回流提取，自然冷却，用倾泻法将烧瓶中的提取液转移到烧杯中，用少量甲醇洗涤烧瓶2～3次，合并提取液，定容至250 mL容量瓶。
1.2.5 正交試验设计 以二氢杨梅素的含量为指标，对影响二氢杨梅素含量的甲醇用量（100、150、200 mL）、提取温度（75℃、80℃、85℃）、提取时间（4、6、8 h）3个因素进行L9（34）等水平正交试验设计，确定最佳提取条件。
1.3 含量测定
1.3.1 二氢杨梅素标准曲线的制备 称取适量二氢杨梅素纯品，制得浓度梯度为2、4、6、8、10 μg·mL-1的标准液，并依次于酶标仪中测量。求得291 nm处吸光度，以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.2 藤茶果实中二氢杨梅素含量测定 采用紫外分光光度法测定藤茶中二氢杨梅素的含量[5]。称取1.000 g藤茶果实粉末，索氏提取后，将容量瓶中的提取液用200 μL移液枪移至96孔板中，移4～6个置于酶标仪中，测量291 nm下的吸光度，取其平均值，然后在二氢杨梅素标准曲线上查出相应含量。
1.4 数据处理
利用OriginPro 8.0软件进行数据分析，采用SPSS 20.0进行正交试验数据的方差分析。
2 结果与分析
2.1 二氢杨梅素的扫描吸收光谱
结合扫描吸收光谱与相关文献报道，确定最大吸收峰为291 nm，故采用291 nm作为二氢杨梅素浓度测定的波长（图1）。
2.2 溶剂及果实部位对二氢杨梅素提取量的影响
藤茶果实中的二氢杨梅素显著高于藤茶种子;且藤茶果实的甲醇提取物中二氢杨梅素含量显著高于乙醇提取物（图2）。故采用甲醇作为藤茶果实中二氢杨梅素的抽提试剂。
2.3 二氢杨梅素标准曲线
以二氢杨梅素浓度为横坐标，291 nm吸光度值为纵坐标，绘制散点图（图3），通过非线性回归分析，建立回归方程为：y =-0.04114+0.03626×e0.2039x，R=0.93719;回归方程极显著。
2.4 正交试验结果
正交试验结果表明，3个因素对藤茶果实二氢杨梅素提取影响程度大小依次为温度、甲醇用量、时间，各因素最优水平组合为A2B3C2（表1）。
方差分析表明（表2），在显著性水平α=0.10时，甲醇用量A和时间C两因素的各水平间差异不显著（P>0.10）;而温度B各水平间差异显著（P<0.10）。综合表1～2结果，得到最佳可行提取工艺组合为A2B3C1，即温度85℃、甲醇用量150 mL、时间4 h，此提取条件下的OD值为2.84。
2.5 验证试验结果
将最适条件下提取液分别稀释0、5、10、20倍，测得其吸光度值分别为2.7955、0.4999、0.3356、0.1839。其中，稀释20倍的样本吸光数值处在二氢杨梅素标准曲线取值范围内，因此将数 据0.1839代入回归方程 中，求得x=8.95 μg·mL-1，在该条件下藤茶果实中二氢杨梅素提取量为179.06 μg·mL-1，换算得出藤茶果实中二氢杨梅素含量44.77 mg·g-1。
3 讨论与结论
目前，有关用藤茶提取二氢杨梅素的提取工艺已有大量研究报道[6-9]，但大多均是以藤茶幼嫩茎叶为材料进行提取，围绕藤茶果实及种子的二氢杨梅素提取工艺鲜见报道。
研究表明，湖南省张家界藤茶果实中二氢杨梅素含量为6.255%，而叶片中二氢杨梅素含量为13.3%～25.5%[10]，果实中二氢杨梅素含量显著低于叶片中二氢杨梅素含量。其他研究表明产自湖南郴州、湖南湘潭和福建武夷山的藤茶（存放1年）叶片、花和叶柄中二氢杨梅素含量分别为3.83～3.99 mg·g-1、1.29～1.44 mg·g-1和0.98～1.04 mg·g-1;采用晒干方式加工藤茶的二氢杨梅素平均含量为4.72 mg·g-1，是采用热风烘干方式的1.2倍;且不同存放时间藤茶二氢杨梅素含量由高到低为存放2年、存放1年、存放3年，存放2年的藤茶二氢杨梅素含量平均含量达到14.42 mg·g-1，是存放3年的13.87倍[3]。可以看出不同产地、不同器官、不同加工方法，甚至不同存放时间对藤茶中二氢杨梅素的含量均有较大影响。
本试验显示影响藤茶果实二氢杨梅素提取效果的因素中，温度>甲醇用量>时间，这一结果与藤茶干燥茎叶基于索氏提取的文献报道一致[11-12]。试验测得藤茶果实索氏提取法最佳提取条件为温度85℃，甲醇用量150 mL，时间4 h;在此条件下，藤茶果实中二氢杨梅素含量为44.77 mg·g-1。该试验结果可为藤茶果实的开发与利用奠定基础。
参考文献：
[1]周防震，郑小江.中国良种—藤茶[M].武汉：湖北科学技术出版社，2016：1.
[2]雷燕妮，张小斌，李多伟.显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素超声提取工艺的优化[J].贵州农业科学，2018，46（5）：123-126.
[3]杨志坚，温杭凯，陈选阳，等.藤茶总黄酮和二氢杨梅素含量研究[J].福建农业科技，2017（10）：6-9.
[4]陈玉琼，李安琪，孟燕.藤茶黄酮及二氢杨梅素提取条件的优化[J].华中农业大学学报，2009，28（1）：106-110.
[5]刘建兰，于华忠，高梦，等.藤茶总黄酮和二氢杨梅素的提取检测研究进展[J].广东农业科学，2013，40（19）： 90-93.
[6]陈雁梅，于华忠，刘同方，等.酶法提取藤茶茎中二氢杨梅素工艺研究[J].应用化工，2016，45（2）：304-307.
[7]熊伟，王慧宾，李雄辉，等.热水浸提法同步提取藤茶中二氢杨梅素和多糖的工艺研究[J].生物化工，2015（1）：5-6，11.
[8]刘畅，邓薇，刘小英，等.藤茶生物活性成分及其制备工艺研究进展[J].食品工业，2015，36（4）：233-237.
[9]郑琳，龚自明.破壁式方法提取藤茶中二氢杨梅素的工艺研究[J].湖北农业科学，2018，57（22）：118-119，121.
[10]周耀，丰来，周政.藤茶植株叶果与组培物中二氢杨梅素含量的比较研究[J].湖南农业科学，2012，7（13）：105-107.
[11]熊璞，姚茂君，肖凯军.藤茶中二氢杨梅素的提取工艺研究[J].现代食品科技，2009，25（8）：907-910.
[12]涂招秀，熊伟，胡居吾，等.藤茶中二氢杨梅素的提取纯化工艺研究[J].江西食品工业，2011（2）：33-36.
（责任编辑：柯文辉）