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摘要:本实验研究了泥炭水解液对米曲霉沪酿3.042的孢子生长速度以及种曲蛋白酶活性和成曲蛋白酶活性的影响。
关键词:泥炭酸(水)解液——peat水解液 生长速率——The rate of growth 蛋白酶酶活——The activity of protein
1 概述
泥炭是不完全分解的植物残体堆积物。因为它是不完全分解产物的堆积物。其成份相当复杂:水、纤维素、半纤维素、腐殖酸、石蜡,还有少量游离的氨基酸与金属离子。通过不同的酸,不同浓度的酸进行酸解,所得的泥炭水解液的成份及其组成含量均不尽相同,即使是用同一种酸、同种浓度,也会因为处理时间与处理的程序不同,泥炭水解液的成份及含量也有所差异。
对于泥炭的开发利用,在国外,是作为发酵工业基质原料来培养微生物,目前主要限于酵母菌和食用菌的某些种属;在国内,早些时候,对泥炭的开发与利用,主要是将之作为一种建筑材料加以利用;目前,也曾有报道:泥炭水解液作为一些食用菌的发酵底物、热带假丝酵母生产单细胞蛋白(scp)。在这些对于泥炭的开发利用中,泥炭水解液是作为碳源,将之添加到培养基质中去的,且结果有一定程度的增产作用。我们观察了泥炭水解液对米曲霉孢子发芽率、生长速率以及蛋白酶酶活的影响,现将结果报道如下:
2 材料与方法
2.1 菌种:沪酿3.042米曲霉,安徽大学生命科学院菌种室提供。
2.2 泥炭:采自安徽省繁昌县。
2.3 培养基
2.3.1 (斜面)培养基:参照《发酵调味品生产技术》(上册)。
2.3.2 三角瓶种曲培养基:豆饼:麸皮=20:80,含水量与干料100%。
2.3.3 成曲培养基:同2.3.1——麸曲培养基:10豆饼/1麸皮。
2.4 泥炭水解液制备:参考A.M.Martin等人的方法。
2.5 细胞培养:二次活化,再低浓度梯度,peat水解液培养训化,最后三角瓶扩大,成曲制备等实验。
2.6 试验方法
本实验按泥炭水解液含量分6个试验组种曲,成曲培养基中泥炭水解液含量分别为:0%、10%、15%、20%、25%、30%。
2.6.1 种曲接种:取7支经训化阶段的30%度管菌种,再支加无菌水3ml,轻划后倒入无菌玻璃珠三角瓶制成孢基液,以接种量为1ml/支(三角瓶)接种到含peat水解液的试验组;取3支同样阶段的对照试管菌种,重复上述步骤,以相同接种量接种至对照组。29-31℃培养,18.5h第一次翻曲,24h第二次翻曲,再培养2天即可。
2.6.2 成曲接种:分别取对照,30%的种曲5g于无菌水+玻珠的三角瓶内制成孢基液,对应接种,接种量为1ml/支(三角瓶)30-25℃培养,11.5h第一次翻曲,18h第二次翻曲,27h成曲成熟。
2.6.3 种曲蛋白酶活测定时的接种量同2.6.2,30-35℃培养,18h第一次翻曲,24.5h第二次翻曲,继续培养至66h即可。
2.6.4 酶活测定:参照Folin法测蛋白酶活,在40℃下,每分钟水解絡蛋白产生1mg絡氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
蛋白酶活力单位=A/10×4N
其中A为样品测得的OD值,查标准曲线得到的酷氨酸的微克数。
10克为反应时间是10分钟。
4为4ml反应液中取1ml测来(即4倍)。
N为酶液稀释倍数。
3 结果与讨论
3.1 peat水解液对沪酿3.042生长速度影响:
注:表1中长度指的是孢子平面向下延伸的长度。
从表1可看出随时间的延长,孢子平面向下加快延伸,但后一阶段增长百分比一般比前一阶段增长百分值低,这与越向下,培养基通气情况越差有关;随peat水解液含量的增加,延长速率也加快,说明peat水解液对3.042的生长速率有较明显的刺激作用。
3.2 peat水解液对3.042蛋白酶活性影响。
3.2.1 peat水解液对于3.042种曲蛋白酶活影响
种曲蛋白酶的多少虽与最后的发酵关系不大,但它活性大小可反映种曲的质量,也一定程度上反映出种曲的孢子数多少;考虑种曲中提取高活性的蛋白酶用于后期发酵,以缩短发酵周期,改善酱油风味等方面提供一条思路。
从表2可看出此种种曲蛋白酶(中性)酶活多数在2-3×103单位之间,且随peat水解液浓度的升高,蛋白酶活性亦随之增加,说明peat水解液对种曲蛋白酶活有一定程度上的刺激作用。
3.2.2 peat水解液对沪酿3.042成曲蛋白酶活影响
成曲蛋白酶活性大小,是酱油酿造中成曲质量高低的一个重要指标;同时成曲酶活也将直接影响后期发酵周期长短,酱油质量的优劣、原料中N源利用率高低等许多方面。
从表3可以看出此种成曲蛋白酶活性多在1-2×103单位之间。近种曲酶活性的一半;随peat水解液含量的增加,成曲中蛋白酶活性有一定程度的增加,说明peat水解液对沪酿3.042成曲蛋白酶活有一定的促进作用。
4 小结与思考
以上通过讨论peat水解液对米曲霉沪酿3.042的影响,结果表明:尤其是生长速率和种曲、成曲蛋白酶活,其促进作用在本实验中最高可达:生长速率+15.88%,种曲酶活可达+23.04%,成曲酶活可达+29.53%,由本实验结果可得出以下结论:
①peat水解液对于沪酿3.042生长速率及种曲、成曲蛋白酶活则有较明显的刺激作用,其中,peat水解液含量为30%的试验组所得结果最为明显。
②考虑到peat水解液成份含量的不均一性及其制备工艺的繁琐性,不易大规模生产,但实际生产过程中可以考虑把peat水解液作为生长因子添加到培养基质中去,为酱油酿造新工艺的选择与设计提供一点参考。
③由本实验结果可以看出,peat水解液对沪酿3.042蛋白酶活性有相当的刺激作用,由此可以得到点启发:peat水解液在酶制品工艺方面可能有广阔的应用前景,这还须进一步研究。
参考文献:
[1]Futhsman.c.m.peat:Industical chemistry and Technology, New York,Aoademic press.1980.18
[2]王怡平等.《中國食用菌》1995.2.37—40.
[3]肖亚中等.《生的学杂志》1996.4.18—110.
[4]Martin.A.M.Can.J.Microbilo 1990.29.108—110.
[5]上海市粮油工业公司、上海市酿造科学研究所、《发酵调味品生产技术》(上册)1978;轻工业出版社(中册)1979.
[6]江清彦等.《中国调味品》1990.11.6-9.
关键词:泥炭酸(水)解液——peat水解液 生长速率——The rate of growth 蛋白酶酶活——The activity of protein
1 概述
泥炭是不完全分解的植物残体堆积物。因为它是不完全分解产物的堆积物。其成份相当复杂:水、纤维素、半纤维素、腐殖酸、石蜡,还有少量游离的氨基酸与金属离子。通过不同的酸,不同浓度的酸进行酸解,所得的泥炭水解液的成份及其组成含量均不尽相同,即使是用同一种酸、同种浓度,也会因为处理时间与处理的程序不同,泥炭水解液的成份及含量也有所差异。
对于泥炭的开发利用,在国外,是作为发酵工业基质原料来培养微生物,目前主要限于酵母菌和食用菌的某些种属;在国内,早些时候,对泥炭的开发与利用,主要是将之作为一种建筑材料加以利用;目前,也曾有报道:泥炭水解液作为一些食用菌的发酵底物、热带假丝酵母生产单细胞蛋白(scp)。在这些对于泥炭的开发利用中,泥炭水解液是作为碳源,将之添加到培养基质中去的,且结果有一定程度的增产作用。我们观察了泥炭水解液对米曲霉孢子发芽率、生长速率以及蛋白酶酶活的影响,现将结果报道如下:
2 材料与方法
2.1 菌种:沪酿3.042米曲霉,安徽大学生命科学院菌种室提供。
2.2 泥炭:采自安徽省繁昌县。
2.3 培养基
2.3.1 (斜面)培养基:参照《发酵调味品生产技术》(上册)。
2.3.2 三角瓶种曲培养基:豆饼:麸皮=20:80,含水量与干料100%。
2.3.3 成曲培养基:同2.3.1——麸曲培养基:10豆饼/1麸皮。
2.4 泥炭水解液制备:参考A.M.Martin等人的方法。
2.5 细胞培养:二次活化,再低浓度梯度,peat水解液培养训化,最后三角瓶扩大,成曲制备等实验。
2.6 试验方法
本实验按泥炭水解液含量分6个试验组种曲,成曲培养基中泥炭水解液含量分别为:0%、10%、15%、20%、25%、30%。
2.6.1 种曲接种:取7支经训化阶段的30%度管菌种,再支加无菌水3ml,轻划后倒入无菌玻璃珠三角瓶制成孢基液,以接种量为1ml/支(三角瓶)接种到含peat水解液的试验组;取3支同样阶段的对照试管菌种,重复上述步骤,以相同接种量接种至对照组。29-31℃培养,18.5h第一次翻曲,24h第二次翻曲,再培养2天即可。
2.6.2 成曲接种:分别取对照,30%的种曲5g于无菌水+玻珠的三角瓶内制成孢基液,对应接种,接种量为1ml/支(三角瓶)30-25℃培养,11.5h第一次翻曲,18h第二次翻曲,27h成曲成熟。
2.6.3 种曲蛋白酶活测定时的接种量同2.6.2,30-35℃培养,18h第一次翻曲,24.5h第二次翻曲,继续培养至66h即可。
2.6.4 酶活测定:参照Folin法测蛋白酶活,在40℃下,每分钟水解絡蛋白产生1mg絡氨酸,定义为1个蛋白酶活力单位。
蛋白酶活力单位=A/10×4N
其中A为样品测得的OD值,查标准曲线得到的酷氨酸的微克数。
10克为反应时间是10分钟。
4为4ml反应液中取1ml测来(即4倍)。
N为酶液稀释倍数。
3 结果与讨论
3.1 peat水解液对沪酿3.042生长速度影响:
注:表1中长度指的是孢子平面向下延伸的长度。
从表1可看出随时间的延长,孢子平面向下加快延伸,但后一阶段增长百分比一般比前一阶段增长百分值低,这与越向下,培养基通气情况越差有关;随peat水解液含量的增加,延长速率也加快,说明peat水解液对3.042的生长速率有较明显的刺激作用。
3.2 peat水解液对3.042蛋白酶活性影响。
3.2.1 peat水解液对于3.042种曲蛋白酶活影响
种曲蛋白酶的多少虽与最后的发酵关系不大,但它活性大小可反映种曲的质量,也一定程度上反映出种曲的孢子数多少;考虑种曲中提取高活性的蛋白酶用于后期发酵,以缩短发酵周期,改善酱油风味等方面提供一条思路。
从表2可看出此种种曲蛋白酶(中性)酶活多数在2-3×103单位之间,且随peat水解液浓度的升高,蛋白酶活性亦随之增加,说明peat水解液对种曲蛋白酶活有一定程度上的刺激作用。
3.2.2 peat水解液对沪酿3.042成曲蛋白酶活影响
成曲蛋白酶活性大小,是酱油酿造中成曲质量高低的一个重要指标;同时成曲酶活也将直接影响后期发酵周期长短,酱油质量的优劣、原料中N源利用率高低等许多方面。
从表3可以看出此种成曲蛋白酶活性多在1-2×103单位之间。近种曲酶活性的一半;随peat水解液含量的增加,成曲中蛋白酶活性有一定程度的增加,说明peat水解液对沪酿3.042成曲蛋白酶活有一定的促进作用。
4 小结与思考
以上通过讨论peat水解液对米曲霉沪酿3.042的影响,结果表明:尤其是生长速率和种曲、成曲蛋白酶活,其促进作用在本实验中最高可达:生长速率+15.88%,种曲酶活可达+23.04%,成曲酶活可达+29.53%,由本实验结果可得出以下结论:
①peat水解液对于沪酿3.042生长速率及种曲、成曲蛋白酶活则有较明显的刺激作用,其中,peat水解液含量为30%的试验组所得结果最为明显。
②考虑到peat水解液成份含量的不均一性及其制备工艺的繁琐性,不易大规模生产,但实际生产过程中可以考虑把peat水解液作为生长因子添加到培养基质中去,为酱油酿造新工艺的选择与设计提供一点参考。
③由本实验结果可以看出,peat水解液对沪酿3.042蛋白酶活性有相当的刺激作用,由此可以得到点启发:peat水解液在酶制品工艺方面可能有广阔的应用前景,这还须进一步研究。
参考文献:
[1]Futhsman.c.m.peat:Industical chemistry and Technology, New York,Aoademic press.1980.18
[2]王怡平等.《中國食用菌》1995.2.37—40.
[3]肖亚中等.《生的学杂志》1996.4.18—110.
[4]Martin.A.M.Can.J.Microbilo 1990.29.108—110.
[5]上海市粮油工业公司、上海市酿造科学研究所、《发酵调味品生产技术》(上册)1978;轻工业出版社(中册)1979.
[6]江清彦等.《中国调味品》1990.11.6-9.