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摘要：目的：探讨结核杆菌抗酸染色与实时荧光PCR法检测效果比较。方法：统计分析我院2019年10月至2020年12月期间结核门诊398例影像检查疑似结核患者，同时进行涂片抗酸染色和实时荧光PCR结核菌DNA检测进行效果比较。结果：实时荧光PCR结核菌DNA检测敏感度、特异性对比与抗酸染色涂片法较高，P<0.05，数据指标之间具有统计学计算意义。作为肺结核的有效诊断方法，可以为临床治疗提供依据，值得推广使用。
关键词：结核杆菌;抗酸染色;实时荧光PCR
结核病及时准确的诊断，对结核病预防与治疗，至关重要。结核病是结核分枝杆菌引起的慢性传染病。实验室检测手段有细菌学检查、免疫学检测、分子生物学检测。我科开展的检测手段有抗酸染色、实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测。抗酸染色涂片法要求设备简单、实验时间短、操作简便、成本低廉等临床优势。结核杆菌核酸检测法（实时荧光PCR法）对实验室人员要求高，特异性强，敏感性高，大大地提高了检测的准确度资料与方法。
1.1资料 在2019年10月至2020年12月期间来院结核门诊就诊，影像学怀疑为结核病的398例患者，作为这次的分析对象。最大年98岁，最小年龄13岁。男性279例，女性119例。
1.2方法
抗酸染色：收集患者3份痰标本（即时痰、夜间痰和晨痰）进行痰涂片，痰涂片大小10mm x20mm，厚薄刚好透过报纸的5号字体，镜下每个视野20个左右细胞。在痰片自然干燥后，用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗，滴加吕氏美兰染液复杂30秒～1分钟，自来水冲洗，自然干燥后油镜观察100个视野 ，查见有抗酸杆菌即为阳性。仪器使用奥林巴斯显微镜。
实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测：收集患者3份痰标本（即时痰、夜间痰和晨痰），加入标本体积1-2倍的4%氢氧化钠震荡30分钟左右完全液化，将液化后3份标本混合在一起，枪头或吸管混匀后吸取0.5ml至1.5ml离心管中， 15000rpm离心5分钟; 去上清，沉淀加无菌生理盐水1ml打匀，15000rpm 离心5分钟;再重复洗涤一次; 去上清，沉淀中加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10 分钟;12000 rpm 离心5分钟，备用。实时荧光PCR TB-DNA检测是用一对结核分枝杆菌特异性引物和一条结核分枝杆菌特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸 v0123单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测结核分枝杆菌DNA。试验严格遵守试剂盒说明书实验室SOP文件操作，如果Ct 值<30，则实验结果为阳性。仪器使用eppendoye centrifuge 5430 R低温高速离心机，SLAN-96、荧光定量PCR扩增仪。试剂厂家是中山大学达安基因股份有限公司。
1.3 统计学方法
本次统计分析的来我院结核门诊就诊，影像学X光疑似为结核病的398例患者痰检数据均率入到SPSS19.0 for Windows 统计学软件实施处理，痰涂片抗酸染镜检法与结核杆菌DNA检测符合率比较用率（%）的形式表示，采用卡方检验P<0.05，数据指标之间具有统计学计算意义。
2.结果
2.1 比较分析抗酸染色涂片法与实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测阳性率符合情况。
检测数据分析可见，398名检测者中，痰涂片抗酸染色54例，阳性率13.57%;实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测阳性112例，阳性率28.14%。敏感性、特异性对比与抗酸染色涂片法较高，P<0.05，数据指标之间具有统计学计算意义。
3.討论
结核病是人类疾病中最古老的传染病之一，在全球传染病中己成为成年人的首要死因。我国2019年新发结核病患者达到83.3万例，死亡3.1万例，从全球范围来讲，结核病问题不仅是一个健康卫生的问题，也是一个国计民生的经济问题，还是一个可能牵连国家和地区能否稳定和发展的社会问题[1]。结核病是结核分枝杆菌引起的慢性传染病，结核菌阳性患者是最主要的传染源，痰检是肺结核检查诊断的有效手段。痰检实验检测手段有痰涂片抗酸染色、实时荧光PCR TB-DNA检测、痰结核杆菌培养。痰结核杆菌培养快者2-3周，慢者2-3个月，时间周期长。为结核治疗提供依据，及时准确的诊断结核病，有效地控制传染源，对预防、治疗结核病至关重要。
现阶段，痰涂片抗酸染色与实时荧光PCR 检测为最常见的实验室检测手段。痰涂片抗酸染色是利用结核分枝杆菌的细胞壁上的脂类不容易着色，对其延长染色的时间，细胞壁上的脂类着色后，不容易被 酸性脱色剂脱去 ，通过显微镜观察视野中是否有被染成红色的结核杆菌 ，来判断临床疑似肺结核的患者是否被结核分枝杆菌感染 ，这种方法具有操作方便 、价格便宜的优点 [2] ，但是痰涂片抗酸染色易受痰标本的质量、染色时间、工作人员的经验情况的影响，造成漏检。PCR技术具有高敏感性和高特异性，对标本要求较低，结核分枝杆菌极少的情况下也可检出，利用实时荧光PCR法检测结核分枝杆菌结果的准确性、稳定性及重复性大大提高。
通过用上述两种方法进行效果比较，结论两种检测方法皆是临床上迅速检测结核分枝杆菌的有效方法，，其中荧光定量PCR敏感度高，应用在初筛中效果更为显著[3]。实时荧光PCR TB-DNA检测作为肺结核的有效诊断方法，可以为临床治疗提供依据，值得推广使用。
参考文献：
[1] 朱国峰 关注并引领结核病免疫学领域的基础理论与创新技术发展 结核与肺部疾病杂志 ，2020，12（3）193-194。
[2]秦 庆 胡 瑛 吕永 强 痰涂片抗酸染色、结核抗体试验、荧光PCR、 T-SPOT.TB在肺结核诊断中的临床意义 中国医学科学 2017，11 （7） ，130-134。
[3] 梁少碧 荧光写量PCR和双抗原夹心胶体免疫层析法检测结核分枝杆菌的对比观察 [M] 结核与肺部健康杂志 2013，6（20），112-114。
关键词：结核杆菌;抗酸染色;实时荧光PCR
结核病及时准确的诊断，对结核病预防与治疗，至关重要。结核病是结核分枝杆菌引起的慢性传染病。实验室检测手段有细菌学检查、免疫学检测、分子生物学检测。我科开展的检测手段有抗酸染色、实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测。抗酸染色涂片法要求设备简单、实验时间短、操作简便、成本低廉等临床优势。结核杆菌核酸检测法（实时荧光PCR法）对实验室人员要求高，特异性强，敏感性高，大大地提高了检测的准确度资料与方法。
1.1资料 在2019年10月至2020年12月期间来院结核门诊就诊，影像学怀疑为结核病的398例患者，作为这次的分析对象。最大年98岁，最小年龄13岁。男性279例，女性119例。
1.2方法
抗酸染色：收集患者3份痰标本（即时痰、夜间痰和晨痰）进行痰涂片，痰涂片大小10mm x20mm，厚薄刚好透过报纸的5号字体，镜下每个视野20个左右细胞。在痰片自然干燥后，用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗，滴加吕氏美兰染液复杂30秒～1分钟，自来水冲洗，自然干燥后油镜观察100个视野 ，查见有抗酸杆菌即为阳性。仪器使用奥林巴斯显微镜。
实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测：收集患者3份痰标本（即时痰、夜间痰和晨痰），加入标本体积1-2倍的4%氢氧化钠震荡30分钟左右完全液化，将液化后3份标本混合在一起，枪头或吸管混匀后吸取0.5ml至1.5ml离心管中， 15000rpm离心5分钟; 去上清，沉淀加无菌生理盐水1ml打匀，15000rpm 离心5分钟;再重复洗涤一次; 去上清，沉淀中加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10 分钟;12000 rpm 离心5分钟，备用。实时荧光PCR TB-DNA检测是用一对结核分枝杆菌特异性引物和一条结核分枝杆菌特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸 v0123单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测结核分枝杆菌DNA。试验严格遵守试剂盒说明书实验室SOP文件操作，如果Ct 值<30，则实验结果为阳性。仪器使用eppendoye centrifuge 5430 R低温高速离心机，SLAN-96、荧光定量PCR扩增仪。试剂厂家是中山大学达安基因股份有限公司。
1.3 统计学方法
本次统计分析的来我院结核门诊就诊，影像学X光疑似为结核病的398例患者痰检数据均率入到SPSS19.0 for Windows 统计学软件实施处理，痰涂片抗酸染镜检法与结核杆菌DNA检测符合率比较用率（%）的形式表示，采用卡方检验P<0.05，数据指标之间具有统计学计算意义。
2.结果
2.1 比较分析抗酸染色涂片法与实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测阳性率符合情况。
检测数据分析可见，398名检测者中，痰涂片抗酸染色54例，阳性率13.57%;实时荧光PCR法结核分枝杆菌核酸检测阳性112例，阳性率28.14%。敏感性、特异性对比与抗酸染色涂片法较高，P<0.05，数据指标之间具有统计学计算意义。
3.討论
结核病是人类疾病中最古老的传染病之一，在全球传染病中己成为成年人的首要死因。我国2019年新发结核病患者达到83.3万例，死亡3.1万例，从全球范围来讲，结核病问题不仅是一个健康卫生的问题，也是一个国计民生的经济问题，还是一个可能牵连国家和地区能否稳定和发展的社会问题[1]。结核病是结核分枝杆菌引起的慢性传染病，结核菌阳性患者是最主要的传染源，痰检是肺结核检查诊断的有效手段。痰检实验检测手段有痰涂片抗酸染色、实时荧光PCR TB-DNA检测、痰结核杆菌培养。痰结核杆菌培养快者2-3周，慢者2-3个月，时间周期长。为结核治疗提供依据，及时准确的诊断结核病，有效地控制传染源，对预防、治疗结核病至关重要。
现阶段，痰涂片抗酸染色与实时荧光PCR 检测为最常见的实验室检测手段。痰涂片抗酸染色是利用结核分枝杆菌的细胞壁上的脂类不容易着色，对其延长染色的时间，细胞壁上的脂类着色后，不容易被 酸性脱色剂脱去 ，通过显微镜观察视野中是否有被染成红色的结核杆菌 ，来判断临床疑似肺结核的患者是否被结核分枝杆菌感染 ，这种方法具有操作方便 、价格便宜的优点 [2] ，但是痰涂片抗酸染色易受痰标本的质量、染色时间、工作人员的经验情况的影响，造成漏检。PCR技术具有高敏感性和高特异性，对标本要求较低，结核分枝杆菌极少的情况下也可检出，利用实时荧光PCR法检测结核分枝杆菌结果的准确性、稳定性及重复性大大提高。
通过用上述两种方法进行效果比较，结论两种检测方法皆是临床上迅速检测结核分枝杆菌的有效方法，，其中荧光定量PCR敏感度高，应用在初筛中效果更为显著[3]。实时荧光PCR TB-DNA检测作为肺结核的有效诊断方法，可以为临床治疗提供依据，值得推广使用。
参考文献：
[1] 朱国峰 关注并引领结核病免疫学领域的基础理论与创新技术发展 结核与肺部疾病杂志 ，2020，12（3）193-194。
[2]秦 庆 胡 瑛 吕永 强 痰涂片抗酸染色、结核抗体试验、荧光PCR、 T-SPOT.TB在肺结核诊断中的临床意义 中国医学科学 2017，11 （7） ，130-134。
[3] 梁少碧 荧光写量PCR和双抗原夹心胶体免疫层析法检测结核分枝杆菌的对比观察 [M] 结核与肺部健康杂志 2013，6（20），112-114。