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摘要[目的]验证新型细胞质不育系L-orfH79与其同核异质的近等基因系HL-CMS YTA的区别。[方法]用orfH79和orf290这2种分子标记对L-orfH79和YTA进行分子鉴定，并比较其花粉染色特性、花粉育性、结实率及orfH79表达量。[结果]分子标记鉴定结果显示L-orfH79只含有不育基因orfH79、不含有orf290，YTA同时含有orfH79和orf290。L-orfH79花粉的淀粉沉积比YTA更少，L-orfH79花粉大小均匀，而YTA的花粉形态不一。L-orfH79花粉育性、套袋结实率及自然结实率（都低于10%）略高于YTA（都低于5%）。当L-orfH79中引入恢复基因Rf5或者Rf6后花粉形态和颜色都恢复正常。抽穗期L-orfH79剑叶中的 orfH79表达量低于YTA，在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后会减少orfH79的表达量。[结论]L-orfH79是不同于YTA的新型细胞质雄性不育系，L-Rf5、L-Rf6可作为其恢复系。
关键词 水稻;细胞质雄性不育系;L-orfH79;育性
中图分类号 S511文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）15-0097-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.027
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract[Objective]In order to verify the difference between the new cytoplasmic male sterile line LorfH79 and its isonuclear alloplasmic sterile lines HLCMS YTA.[Method]LorfH79 and YTA were identified by molecular markers orfH79 and orf290， of which pollen dyeing characteristics， pollen fertility， seed setting rate and expression level of orfH79 were compared.[Result]It showed that both orfH79 and orf290 in YTA， while LorfH79 only contained orfH79 but not orf290 by molecular marker identification. The starch deposition of LorfH79 pollen was less than that of YTA. The size of LorfH79 pollen was uniform， but the morphology of YTA pollen was different. The pollen fertility， bagging seed setting rate and natural seed setting rate of LorfH79（all below 10%） were slightly higher than YTA （all below 5%）. Pollen morphology and color returned to normal when the restorer gene Rf5 or Rf6 was introduced into LorfH79. The expression of orfH79 in flag leaves of LorfH79 was lower than that of YTA. The expression of orfH79 reduced in sterile line LorfH79 after introducing Rf5 or Rf6.[Conclusion]LorfH79 is a new cytoplasmic male sterile line that different from YTA. LRf5 and LRf6 can be used as restorer lines.
Key words Rice;Cytoplasmic male sterility;LorfH79;Fertility
基金项目 湖北省技术创新专项重点项目（2018BFC360）;湖北省自然科学基金项目（2018CFB481）;中央高校基本科研业务费专项（CZY18029，CZP17017）。
作者简介 李佳洋（1992—），男，湖北来凤人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事分子遗传学研究。
收稿日期 2019-03-16
水稻細胞质雄性不育是在发育过程中雌蕊正常而花粉败育的现象，属于母性遗传，而特定的基因可以使其育性得到恢复。根据杂种F1代所产生的携带S（rf）基因型的雄配子的育性表型，可将CMS细胞质划分为孢子体细胞质雄性不育（sporophytic type）和配子体细胞质雄性不育（gametophytic type）2种类型[1-2]。孢子体细胞质雄性不育其雄配子（花粉）的育性受孢子体（植侏）的基因型控制，而与雄配子本身所携带的核基因无关。配子体细胞质雄性不育其雄配子的育性直接由雄配子（花粉）本身的基因型所决定，与孢子体（植株）基因型无关[3]。水稻花粉败育分典败、圆败和染败，用I2-KI染色后分别呈现出皱缩不着色，圆形不着色，圆形着色浅且大小不一。1972年，朱英国院士利用红芒野生稻作母本、莲塘早栽培稻作父本杂交，后代得到雄性不育株连续回交多代得到稳定的红莲型细胞质雄性不育系HL-CMS YTA，属配子体不育，YTB是YTA的同核异质保持系[4]。orfH79是YTA中atp6下游200 bp处的可编码79个氨基酸的嵌合片段，ORFH79通过与红莲雄性不育水稻细胞质电子传递链复合体Ⅲ亚基相互作用而损害线粒体功能最终导致不育[5]。orfH79与BT-CMS中的不育基因orf79有96%的同源性[6-7]。HL-sp1是从YTA克隆的与orfH79没有序列同源性的HL-CMS不育相关的候选基因片段[8]，通过Tail-PCR 将该片段扩大至6.7 kb[9]，在HL-sp1中预测到一个新的不育候选基因orf290，因此YTA中包含至少2种不育基因orfH79和orf290[10]。利用orfH79和orf290这2个分子标记，从102份AA基因型野生稻中筛选得到了6个只含有orfH79而不含有orf290的品种，经与YTB反复回交并结合分子标记筛选，获得了与红莲水稻不育系YTA同核异质的近等基因不育系，命名为L-orfH79[11]。前期实验室还以YTA作母本构建了YTA的同质异核近等基因恢复系L-Rf5和L-Rf6[12]，它们可以稳定地恢复L-orfH79的育性。该研究拟通过DNA水平、RNA表达水平及花粉形态及育性几个方面比较具有相同的核背景但是细胞质不一样的L-orfH79和YTA的区别与联系，为该不育系的科研价值和应用推广提供参考依据。 1 材料与方法
1.1 材料
水稻粤泰B（YTB）、粤泰A（YTA）、L-orfH79、L-orf290、L-Rf5、L-Rf6由中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供。ExTaq酶、dNTP Mix、10×PCR Buffer、DL2000 DNA Marker、反转录试剂盒均购买于TaKaRa公司;AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit50-prep购于Axygen公司;TRIzol购于Thermo Fisher公司;DNA引物合成由天一辉远生物技术有限公司（武汉部）完成，该研究使用的引物名称、用途及序列如表1。
1.2 仪器
C1000 touch thermal cycler PCR仪（美国Bio-Rad）;Heraeus Pico 21 Centrifuge微量台式冷冻离心机（德国）;SBD50-1水浴锅（丹麦Heto-Holten）;SS-325 TOMY高压灭菌锅（日本TOMY）;Universal Hold Ⅱ凝胶成像系统（美国）;Nikon SMZ1500荧光体式显微镜（日本Microscop）;净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）;NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪（美国）;QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪（美国）。
1.3 方法
1.3.1
DNA提取。采用CTAB（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）法进行DNA样品抽提。取50 mg新鲜水稻叶片，装入1.5 mL的Eppendorf管中，用液氮迅速冷冻叶片，用研磨棒快速研磨叶片至质地均匀的粉末状，加入650 μL 65 ℃预热的CTAB提取液，充分混匀，放入65 ℃的水浴锅中，每隔15 min轻柔颠倒混匀1次。水浴1 h后加入650 μL氯仿，轻柔颠倒混匀20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取450 μL上清，加入900 μL预冷的无水乙醇，轻柔混匀后冰浴15 min。4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，用75%乙醇洗涤后4 ℃ 12 000 r/min离心5 min（重复2次），自然风干至沉淀变为无色透明后加入30 μL TE溶解沉淀，-20 ℃保存。
1.3.2
PCR扩增检测。利用分子标记orfH79和orf290对水稻叶片的DNA进行PCR扩增，20 μL扩增体系包括10× ExTaq Buffer 2 μL、ExTaq DNA聚合酶 0.1 μL、dNTP Mix 1.6 μL、引物F和R各0.4 μL、DNA模板 25 ng，ddH2O 补加至总体积为20 μL。扩增程序为95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，X ℃退火Y s，72 ℃延伸55 s，35个循环;72 ℃延伸7 min。扩增orfH79的X为55 ℃，Y为50 s;扩增orf290的X为62 ℃，Y为50 s。PCR扩增结束后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.3.3 花粉镜检及育性统计。采用1% I2-KI染色法进行花粉镜检。取成熟且未裂开的小穗，立即用剪刀小心剪开颖壳，取出花药，放在洁净干燥的载玻片上，取一滴I2-KI染液，用镊子夹碎花粉粒，使花粉充分溶解到I2-KI染液里，夹走多余杂质，利用体视显微镜观察花粉染色情况并统计。取小穗后进行套袋自交，成熟后统计套袋结实率和自然结实率。
1.3.4 RNA提取。TRIzol法，取水稻剑叶于RNase free并预冷的研钵中，加入液氮研磨至呈白色粉末状，加入1 mL TRIzol溶液，剧烈混匀后，冰上静置5 min;再向EP管中加入200 mL氯仿，摇床上振荡15 min，冰上静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心12 min（重复2次），用 RNase free tip头小心吸取500 μL上清至新的1.5 mL RNase free EP管中;加333 μL的异丙醇，轻轻混匀后室温静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心12 min，有白色RNA沉淀出现;弃掉上清液，向EP管中加入1 mL 75%乙醇（用DEPC水配制），洗滌沉淀RNA，洗涤过程中用tip头小心吹打使沉淀漂浮起来，静置5 min;4 ℃ 800 r/min离心5 min，弃掉上清液，重复洗涤1次;然后将EP管置于超净工作台上风干沉淀至无色透明状，加入30 μL RNase free水溶解;充分溶解后用65 ℃水浴15 min变性，置于-80 ℃保存。
1.3.5
RNA反转成cDNA以及cDNA的检测。RNA琼脂糖电泳检测无降解后，取1 μL RNA用于浓度测定，根据测定浓度，取1 μg RNA反转录成cDNA。首先去除RNA中的基因组DNA，反应体系包括5×g DNA Eraser buffer 2 μL、1 μg RNA、gDNA Eraser 1 μL、RNase free ddH2O补充至10 μL。反应程序为42 ℃ 2 min后置于冰浴，马上再进行反转录。反转录反应是在去除gDNA 反应体系中加RNase free ddH2O 4 μL、5×Primer Script buffer 4 μL、RT Primer Mix 1 μL、Primer Script RT Enzyme Mix 1 μL。反转录反应程序为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。然后将cDNA用RNase free ddH2O稀释4倍，即可作为PCR模板来进行cob检测。
1.3.6 RT-PCR检测表达量。利用SYBR染色法检测不同材料剑叶中orfH79的表达量。15 μL qRT-PCR反应体系包括SYBR 7.5 μL、引物 F和R（10 μmol/L）各0.6 μL、cDNA 3 μL、去离子水 3.3 μL。扩增程序为50 ℃ 20 s;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60.5 ℃ 1 min，40个循环;95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 15 s。以cob为内参基因，扩增完成后根据收集的数据和相关公式计算并作相对表达量柱状图。 2 结果与分析
2.1 新型胞质不育系L-orfH79不育基因的分子标记检测
用orfH79和orf290 2个分子标记在L-orfH79材料和YTA、YTB中扩增，结果表明YTA和L-orfH79材料都含有orfH79，同時YTA还含有orf290，但L-orfH79材料不含orf290（图1）。
2.2 新型胞质不育系L-orfH79花粉形态特征
对新型胞质不育系L-orfH79花粉用1% I2-KI染色，相同观测条件下L-orfH79的淀粉沉积比YTA更少（图2）。统计结果显示L-orfH79花粉几乎全为不育，85%属于圆败，8%属于典败，L-orfH79花粉大小十分均匀。而YTA的花粉84%属于圆败，13%属于典败，形态不一。当L-orfH79中引入恢复基因Rf5或者Rf6后花粉形态和颜色都恢复正常。
2.3 新型胞质不育系L-orfH79育性特征
分别统计8株
L-orfH79与YTA的育性，结果如表2。就花粉育性而言，L-orfH79为8.0%，略高于YTA的3.5%;L-orfH79的套袋结实率为6.9%，比YTA的3.1%略高;自然结实率L-orfH79为85%，略高于YTA的4.7%。综上所述，从花粉育性、套袋结实率、自然结实率3个方面都说明L-orfH79不同于YTA，YTA的育性更低且更稳定，但是 L-orfH79的育性也十分接近一个成熟不育系的育性。
2.4 不育基因orfH79相对表达量的比较分析
为了分析YTA和L-orfH79在不育基因orfH79表达量上的区别以及恢复基因Rf5、Rf6对orfH79表达量的影响，提取YTA、L-orfH79、L-orfH79/L-Rf5、L-orfH79/L-Rf6抽穗期剑叶中RNA，反转成cDNA后用内参基因cob检测其质量，检测结果显示质量很好（图3），可以进行后续表达量分析。不同材料中orfH79的表达量测定结果表明L-orfH79抽穗期剑叶中orfH79的表达量低于YTA中，在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后会减少orfH79的表达量（图4）。
3 讨论
通过与YTB反复回交多代，并用分子标记orfH79和orf290筛选得到只含有orfH79的不育系 L-orfH79和同时含有 orfH79和orf290的不育系YTA。有研究表明这种构建不育系的方式可以得到核背景一样但细胞质不同的不育系[13-14]。该研究从DNA水平、RNA水平和花粉镜检以及结实率统计等方面对L-orfH79和YTA进行了比较，发现它们有本质的区别，L-orfH79比YTA少了不育基因orf290，且YTA中的orf290在不同部位都有一定的表达量[15]。L-orfH79中orfH79的相对表达量低于YTA，但是却有着和YTA相近的不育特征，这都说明了L-orfH79是一种不同于YTA的不育系，且育性可以被恢复基因Rf5或Rf6通过下调orfH79的表达量而恢复。这为红莲型水稻胞质雄性不育的核质互作机理研究提供了种质资源。丰富了三系杂交水稻的多样性，将为不育基因后期理论研究和应用研究提供基础。但是L-orfH79和YTA主要不育机理的区别还需要进一步研究。
参考文献
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关键词 水稻;细胞质雄性不育系;L-orfH79;育性
中图分类号 S511文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）15-0097-04
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.027
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Abstract[Objective]In order to verify the difference between the new cytoplasmic male sterile line LorfH79 and its isonuclear alloplasmic sterile lines HLCMS YTA.[Method]LorfH79 and YTA were identified by molecular markers orfH79 and orf290， of which pollen dyeing characteristics， pollen fertility， seed setting rate and expression level of orfH79 were compared.[Result]It showed that both orfH79 and orf290 in YTA， while LorfH79 only contained orfH79 but not orf290 by molecular marker identification. The starch deposition of LorfH79 pollen was less than that of YTA. The size of LorfH79 pollen was uniform， but the morphology of YTA pollen was different. The pollen fertility， bagging seed setting rate and natural seed setting rate of LorfH79（all below 10%） were slightly higher than YTA （all below 5%）. Pollen morphology and color returned to normal when the restorer gene Rf5 or Rf6 was introduced into LorfH79. The expression of orfH79 in flag leaves of LorfH79 was lower than that of YTA. The expression of orfH79 reduced in sterile line LorfH79 after introducing Rf5 or Rf6.[Conclusion]LorfH79 is a new cytoplasmic male sterile line that different from YTA. LRf5 and LRf6 can be used as restorer lines.
Key words Rice;Cytoplasmic male sterility;LorfH79;Fertility
基金项目 湖北省技术创新专项重点项目（2018BFC360）;湖北省自然科学基金项目（2018CFB481）;中央高校基本科研业务费专项（CZY18029，CZP17017）。
作者简介 李佳洋（1992—），男，湖北来凤人，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事分子遗传学研究。
收稿日期 2019-03-16
水稻細胞质雄性不育是在发育过程中雌蕊正常而花粉败育的现象，属于母性遗传，而特定的基因可以使其育性得到恢复。根据杂种F1代所产生的携带S（rf）基因型的雄配子的育性表型，可将CMS细胞质划分为孢子体细胞质雄性不育（sporophytic type）和配子体细胞质雄性不育（gametophytic type）2种类型[1-2]。孢子体细胞质雄性不育其雄配子（花粉）的育性受孢子体（植侏）的基因型控制，而与雄配子本身所携带的核基因无关。配子体细胞质雄性不育其雄配子的育性直接由雄配子（花粉）本身的基因型所决定，与孢子体（植株）基因型无关[3]。水稻花粉败育分典败、圆败和染败，用I2-KI染色后分别呈现出皱缩不着色，圆形不着色，圆形着色浅且大小不一。1972年，朱英国院士利用红芒野生稻作母本、莲塘早栽培稻作父本杂交，后代得到雄性不育株连续回交多代得到稳定的红莲型细胞质雄性不育系HL-CMS YTA，属配子体不育，YTB是YTA的同核异质保持系[4]。orfH79是YTA中atp6下游200 bp处的可编码79个氨基酸的嵌合片段，ORFH79通过与红莲雄性不育水稻细胞质电子传递链复合体Ⅲ亚基相互作用而损害线粒体功能最终导致不育[5]。orfH79与BT-CMS中的不育基因orf79有96%的同源性[6-7]。HL-sp1是从YTA克隆的与orfH79没有序列同源性的HL-CMS不育相关的候选基因片段[8]，通过Tail-PCR 将该片段扩大至6.7 kb[9]，在HL-sp1中预测到一个新的不育候选基因orf290，因此YTA中包含至少2种不育基因orfH79和orf290[10]。利用orfH79和orf290这2个分子标记，从102份AA基因型野生稻中筛选得到了6个只含有orfH79而不含有orf290的品种，经与YTB反复回交并结合分子标记筛选，获得了与红莲水稻不育系YTA同核异质的近等基因不育系，命名为L-orfH79[11]。前期实验室还以YTA作母本构建了YTA的同质异核近等基因恢复系L-Rf5和L-Rf6[12]，它们可以稳定地恢复L-orfH79的育性。该研究拟通过DNA水平、RNA表达水平及花粉形态及育性几个方面比较具有相同的核背景但是细胞质不一样的L-orfH79和YTA的区别与联系，为该不育系的科研价值和应用推广提供参考依据。 1 材料与方法
1.1 材料
水稻粤泰B（YTB）、粤泰A（YTA）、L-orfH79、L-orf290、L-Rf5、L-Rf6由中南民族大学武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室提供。ExTaq酶、dNTP Mix、10×PCR Buffer、DL2000 DNA Marker、反转录试剂盒均购买于TaKaRa公司;AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit50-prep购于Axygen公司;TRIzol购于Thermo Fisher公司;DNA引物合成由天一辉远生物技术有限公司（武汉部）完成，该研究使用的引物名称、用途及序列如表1。
1.2 仪器
C1000 touch thermal cycler PCR仪（美国Bio-Rad）;Heraeus Pico 21 Centrifuge微量台式冷冻离心机（德国）;SBD50-1水浴锅（丹麦Heto-Holten）;SS-325 TOMY高压灭菌锅（日本TOMY）;Universal Hold Ⅱ凝胶成像系统（美国）;Nikon SMZ1500荧光体式显微镜（日本Microscop）;净化工作台（上海新苗医疗器械制造有限公司）;NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪（美国）;QuantStudio 3实时荧光定量PCR仪（美国）。
1.3 方法
1.3.1
DNA提取。采用CTAB（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）法进行DNA样品抽提。取50 mg新鲜水稻叶片，装入1.5 mL的Eppendorf管中，用液氮迅速冷冻叶片，用研磨棒快速研磨叶片至质地均匀的粉末状，加入650 μL 65 ℃预热的CTAB提取液，充分混匀，放入65 ℃的水浴锅中，每隔15 min轻柔颠倒混匀1次。水浴1 h后加入650 μL氯仿，轻柔颠倒混匀20 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取450 μL上清，加入900 μL预冷的无水乙醇，轻柔混匀后冰浴15 min。4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，用75%乙醇洗涤后4 ℃ 12 000 r/min离心5 min（重复2次），自然风干至沉淀变为无色透明后加入30 μL TE溶解沉淀，-20 ℃保存。
1.3.2
PCR扩增检测。利用分子标记orfH79和orf290对水稻叶片的DNA进行PCR扩增，20 μL扩增体系包括10× ExTaq Buffer 2 μL、ExTaq DNA聚合酶 0.1 μL、dNTP Mix 1.6 μL、引物F和R各0.4 μL、DNA模板 25 ng，ddH2O 补加至总体积为20 μL。扩增程序为95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s，X ℃退火Y s，72 ℃延伸55 s，35个循环;72 ℃延伸7 min。扩增orfH79的X为55 ℃，Y为50 s;扩增orf290的X为62 ℃，Y为50 s。PCR扩增结束后，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
1.3.3 花粉镜检及育性统计。采用1% I2-KI染色法进行花粉镜检。取成熟且未裂开的小穗，立即用剪刀小心剪开颖壳，取出花药，放在洁净干燥的载玻片上，取一滴I2-KI染液，用镊子夹碎花粉粒，使花粉充分溶解到I2-KI染液里，夹走多余杂质，利用体视显微镜观察花粉染色情况并统计。取小穗后进行套袋自交，成熟后统计套袋结实率和自然结实率。
1.3.4 RNA提取。TRIzol法，取水稻剑叶于RNase free并预冷的研钵中，加入液氮研磨至呈白色粉末状，加入1 mL TRIzol溶液，剧烈混匀后，冰上静置5 min;再向EP管中加入200 mL氯仿，摇床上振荡15 min，冰上静置5 min，4 ℃，12 000 r/min离心12 min（重复2次），用 RNase free tip头小心吸取500 μL上清至新的1.5 mL RNase free EP管中;加333 μL的异丙醇，轻轻混匀后室温静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心12 min，有白色RNA沉淀出现;弃掉上清液，向EP管中加入1 mL 75%乙醇（用DEPC水配制），洗滌沉淀RNA，洗涤过程中用tip头小心吹打使沉淀漂浮起来，静置5 min;4 ℃ 800 r/min离心5 min，弃掉上清液，重复洗涤1次;然后将EP管置于超净工作台上风干沉淀至无色透明状，加入30 μL RNase free水溶解;充分溶解后用65 ℃水浴15 min变性，置于-80 ℃保存。
1.3.5
RNA反转成cDNA以及cDNA的检测。RNA琼脂糖电泳检测无降解后，取1 μL RNA用于浓度测定，根据测定浓度，取1 μg RNA反转录成cDNA。首先去除RNA中的基因组DNA，反应体系包括5×g DNA Eraser buffer 2 μL、1 μg RNA、gDNA Eraser 1 μL、RNase free ddH2O补充至10 μL。反应程序为42 ℃ 2 min后置于冰浴，马上再进行反转录。反转录反应是在去除gDNA 反应体系中加RNase free ddH2O 4 μL、5×Primer Script buffer 4 μL、RT Primer Mix 1 μL、Primer Script RT Enzyme Mix 1 μL。反转录反应程序为37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s，4 ℃ 保存。然后将cDNA用RNase free ddH2O稀释4倍，即可作为PCR模板来进行cob检测。
1.3.6 RT-PCR检测表达量。利用SYBR染色法检测不同材料剑叶中orfH79的表达量。15 μL qRT-PCR反应体系包括SYBR 7.5 μL、引物 F和R（10 μmol/L）各0.6 μL、cDNA 3 μL、去离子水 3.3 μL。扩增程序为50 ℃ 20 s;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60.5 ℃ 1 min，40个循环;95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;95 ℃ 30 s;60 ℃ 15 s。以cob为内参基因，扩增完成后根据收集的数据和相关公式计算并作相对表达量柱状图。 2 结果与分析
2.1 新型胞质不育系L-orfH79不育基因的分子标记检测
用orfH79和orf290 2个分子标记在L-orfH79材料和YTA、YTB中扩增，结果表明YTA和L-orfH79材料都含有orfH79，同時YTA还含有orf290，但L-orfH79材料不含orf290（图1）。
2.2 新型胞质不育系L-orfH79花粉形态特征
对新型胞质不育系L-orfH79花粉用1% I2-KI染色，相同观测条件下L-orfH79的淀粉沉积比YTA更少（图2）。统计结果显示L-orfH79花粉几乎全为不育，85%属于圆败，8%属于典败，L-orfH79花粉大小十分均匀。而YTA的花粉84%属于圆败，13%属于典败，形态不一。当L-orfH79中引入恢复基因Rf5或者Rf6后花粉形态和颜色都恢复正常。
2.3 新型胞质不育系L-orfH79育性特征
分别统计8株
L-orfH79与YTA的育性，结果如表2。就花粉育性而言，L-orfH79为8.0%，略高于YTA的3.5%;L-orfH79的套袋结实率为6.9%，比YTA的3.1%略高;自然结实率L-orfH79为85%，略高于YTA的4.7%。综上所述，从花粉育性、套袋结实率、自然结实率3个方面都说明L-orfH79不同于YTA，YTA的育性更低且更稳定，但是 L-orfH79的育性也十分接近一个成熟不育系的育性。
2.4 不育基因orfH79相对表达量的比较分析
为了分析YTA和L-orfH79在不育基因orfH79表达量上的区别以及恢复基因Rf5、Rf6对orfH79表达量的影响，提取YTA、L-orfH79、L-orfH79/L-Rf5、L-orfH79/L-Rf6抽穗期剑叶中RNA，反转成cDNA后用内参基因cob检测其质量，检测结果显示质量很好（图3），可以进行后续表达量分析。不同材料中orfH79的表达量测定结果表明L-orfH79抽穗期剑叶中orfH79的表达量低于YTA中，在L-orfH79中引入Rf5或者Rf6后会减少orfH79的表达量（图4）。
3 讨论
通过与YTB反复回交多代，并用分子标记orfH79和orf290筛选得到只含有orfH79的不育系 L-orfH79和同时含有 orfH79和orf290的不育系YTA。有研究表明这种构建不育系的方式可以得到核背景一样但细胞质不同的不育系[13-14]。该研究从DNA水平、RNA水平和花粉镜检以及结实率统计等方面对L-orfH79和YTA进行了比较，发现它们有本质的区别，L-orfH79比YTA少了不育基因orf290，且YTA中的orf290在不同部位都有一定的表达量[15]。L-orfH79中orfH79的相对表达量低于YTA，但是却有着和YTA相近的不育特征，这都说明了L-orfH79是一种不同于YTA的不育系，且育性可以被恢复基因Rf5或Rf6通过下调orfH79的表达量而恢复。这为红莲型水稻胞质雄性不育的核质互作机理研究提供了种质资源。丰富了三系杂交水稻的多样性，将为不育基因后期理论研究和应用研究提供基础。但是L-orfH79和YTA主要不育机理的区别还需要进一步研究。
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