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摘 要：为控制和稳定无细胞百日咳疫苗（Acellular pertussis vaccine，APV）中主要成分的比例，建立了一种适合大规模生产的无细胞百日咳疫苗的纯化新工艺。通过形态超滤对脱毒后的无细胞百日咳抗原进行纯化，比较从纯化样品的纯度与回收率以及效价等方面与透析法进行试验对照。收获前的菌液的pH值调节为5.8-6.0，疫苗的主要保护性抗原的上清液中的含量可明显增加。采用强阳离子交换色谱的方法，可以一步完成从捕获目的蛋白到多成分的分离纯化。在无细胞百日咳抗原溶液中拥有较高的解毒剂和色素的去除效率，在采用形态超滤工艺之后，原液的回收率与效价也高于透析法。建立了一种新的色谱净化工艺，可线性放大，适合大规模生产APV。通过形态超滤法对细胞百日咳抗原进行纯化，可作为透析的替代方法，奠定了疫苗质量标准的基础。
关键词：超滤;百日咳;发酵;纯化
1 引言
百日咳是百日咳菌造成的急性呼吸道疾病之一，在婴幼儿中发病常见，预防百日咳的有效手段是免疫接种百日咳疫苗。百日咳毒素（Pertussis toxin，PT）和丝状血凝素（Filamentoushemagglutinin，FHA）2 种保护性抗原组分为无细胞百日咳疫苗（Acellular pertussis vaccine，APV）主要成分。大发酵罐培养细菌、硫酸铵沉淀、解毒、高盐浓度抽取、透析和蔗糖梯度超离心等步骤构成传统的无细胞百日咳疫苗生产工艺。在维持无细胞百日咳疫苗免疫原性的基础上显著减少副作用的发生。实验基于中空纤维膜过滤系统，通过设定某些超过滤条件，纯化脱毒后无细胞百日咳疫苗原液，实验取得了令人满意的结果。
2 材料与方法
2.1样品
脱毒后的精制无细胞百日咳抗原溶液（以下简称脱毒后的抗原溶液）由菌苗室提供。生物指标、生长特性和毒性生产与目前所使用的菌种是相同的。
2.2主要试剂及仪器
培养基室提供注射用水;从国药集团北京生物制品研究所有限责任公司化学试剂有限公司购氯化钠，为药用级;透析袋购自美国Viskase公司;绵羊抗人PT血清和绵羊抗人FHA血清购自NIBSC公司;HRP标记的兔抗羊IgG购自KPL公司;层析填料S Sepharose Fast Flow（装填体积为500ml）购自GE公司。
2.3无细胞百日咳疫苗原液的超滤纯化
先将脱毒后的抗原溶液用 10 kD 形态超滤柱超滤浓缩 5 倍左右，然后开始洗滤，在滤出体积为4 ～ 5 倍时停止洗滤，用 1 倍滤体积的生理盐水对整个系统进行淋洗回收。精制抗原PBS打入脱毒罐，搅拌10分中，加入2.5%戊二醛，作用4小时后，加入10%赖氨酸，作用2小时（作为化学终止剂），在这两小时中把罐中原液平均分到透析袋里，再入透析槽，透析6天后，收集抗原，打入静置罐，再静置15天后，超声匀化，最后是无细胞百日咳疫苗原液。
2.4无细胞百日咳疫苗原液的透析纯化
透析袋具有一定的阻断分子量功能，比该分子量高的分子物质例如蛋白质不能通过，而某些较小的分子物质，如无机盐，则可以通过半渗透膜进行，该膜可以分离分子中的蛋白质分子。将无病毒抗原溶液包裹在透析袋中并置于0。5%。在85%无菌氯化钠溶液中，将抗原在2～8℃下透析，直至抗原为浅粉色。进行 10 倍体积脱盐预处理使用 0. 01 mol / L PB 缓冲液（pH 5. 8），确保低于 0. 65 mS / cm样品的电导值（25 ℃时的 0. 05 mol / LNaCl 溶液的电导率），离子交换层析上样液被制备成，并对超滤废液进行收集。透析时把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质逐渐降低到最小值为止。
2.5 纯化原液的鉴定
将超滤后和透析后的原液按比例还原至纯化前体积，对照样品为脱毒后的抗原溶液，分析样品的纯度使用12% SDS-PAGE。将各样品 10 000 × g 离心15 min，称量溶液中的固含量，计算回收率;测定透析后及超滤后原液的效价依照《中国药典》三部（2010 版）附录 2 。判定各洗脱组分的热原是否合格的标准采用《中国药典》三部（2005 版）附录“热原检测法”进行判定;电泳图谱中目的蛋白的纯度的分析使用 GelAnalyzer 软件。
3 结果
3.1 形态超滤浓缩和洗滤
70min内滤出4800ml料液由超滤浓缩过程产生，浓缩了5倍，滤速衰减平稳，平均滤速为42LMH（69.6ml/min）;在洗滤过程中，90min内滤出5300ml料液，洗滤倍数为4.4倍，滤速衰减基本平稳，平均滤速为36LMH（59.5ml/min）;随着发酵的增加，FHA的蛋白质含量逐步增加，在细菌中的浓度较低，变化不明显。调节菌液p H值至7.3和6.3時，菌液上清液中PT和FHA含量略有升高。将各纯化成分样品的Westernblot结果进行比较，pH为5.8的加样溶液经色谱柱吸附后，目标蛋白全部被完全捕获且无流动损失。并混合淋洗液与之前的洗滤液（1200ml），2.5倍为原液的最终浓缩倍数。透析法需要更换5次透析液，全过程约为6d。原液的颜色均为浅粉色，在两种方法纯化之后，标准符合《中国药典》三部（2010版）的规定。
3.2 纯化原液的鉴定
依据SDS-PAGE分析结果显示，无细胞百日咳疫苗原液的纯度改变不明显，在经过形态超滤和透析法纯化之后。具有良好的重复性对于建立的纯化新工艺，可达90%以上的目的蛋白回收率，热原均合格经过动物试验检测后。透析纯化略高于超滤纯化的回收率，见表1;超滤纯化的原液效价（11.166IU/ml）高于透析纯化的原液效价（9.211IU/ml），二者均达到《中国药典》三部（2010版）规定的标准（>8.0IU/ml）。 4 讨论
作为用于大分子物质的分离、浓缩和提纯的一种膜分离技术，形态超滤在食品、发酵、医药、环保、化工等行业都有广泛运用。在收获后的浓缩和脱盐作业中，由于膜包的固定大小，对蛋白质的吸附不那么恒定，如果发酵扩大，这一步骤的损失可以明显减少。本文对脱毒后的无细胞百日咳抗原溶液进行纯化使用形态超滤技术，在纯化效果、回收率、效价等方面与以往的透析方法进行了比较。结果表明，去除解毒剂和色谱法效果较好，收率较高，产率高于透析。在实际生产过程中，对不同的电源和液体组件的切向热过滤膜的非专用链路程度不同。在超过滤阶段，目标蛋白质的损失率低于20%。
通过高相色谱法纯化完成了从捕获和浓缩目标蛋白到分离和纯化多个成分的一步，有效缩短了整个下游过程的时间。切向过滤产生了一定的内聚蛋白作用，这对于减少粗心剂的形成是有用的，而透析和超过滤后的创新则是有益的。后者的絮凝蛋白更细腻，且沉降速度更缓慢，因此形态超滤可以提高后期超声波匀化效率，从而间接提高产品的效价。从超滤的外液中未检测到有效抗原，从物料平衡的角度考虑，抗原损失的原因不在于“泄漏”，很可能在于该组分“沉淀”在流体通道及与膜材质表面之间的黏附。下一步將尝试通过增加淋洗次数和增大溶液的离子强度等方法来提高抗原的回收率。
5 结论
由于具有流畅的纤维通道，中空纤维超滤膜柱允许高固含量的混浊物材料自由通脱，因而不发生通道阻塞的情况。临床观察显示，APV和DTAP的免疫效果与百日咳疫苗的免疫效果相似，副作用大大减少。在本实验中，建立了一种可线性放大工艺、以适应大规模的APV生产。应用形态超滤技术纯化无细胞百日咳抗原可替代透析工艺。为疫苗质量标准的提高奠定了基础。
参考文献
[1] 高振轩， 谌志筠， 何秋水. 无细胞百日咳疫苗时代百日咳杆菌黏附素蛋白缺失株的研究进展[J]. 医学综述， 2019， 25（13）.
[2] 潘殊男. 白喉-破伤风-无细胞百日咳-脊髓灰质炎灭活疫苗的临床免疫原性研究进展（续）[J]. 国际生物制品学杂志， 2019， 42（3）：143-146.
[3] 高娜. 响应面法建立层析纯化去除百日咳丝状血凝素中内毒素工艺[J]. 微生物学通报， 2018， 45（6）：1384-1392.
[4] 孟庆红， 史伟， 姚开虎. 百日咳自然感染和疫苗诱导的免疫反应研究进展[J]. 中华实用儿科临床杂志， 2017， 32（10）：794-796.
关键词：超滤;百日咳;发酵;纯化
1 引言
百日咳是百日咳菌造成的急性呼吸道疾病之一，在婴幼儿中发病常见，预防百日咳的有效手段是免疫接种百日咳疫苗。百日咳毒素（Pertussis toxin，PT）和丝状血凝素（Filamentoushemagglutinin，FHA）2 种保护性抗原组分为无细胞百日咳疫苗（Acellular pertussis vaccine，APV）主要成分。大发酵罐培养细菌、硫酸铵沉淀、解毒、高盐浓度抽取、透析和蔗糖梯度超离心等步骤构成传统的无细胞百日咳疫苗生产工艺。在维持无细胞百日咳疫苗免疫原性的基础上显著减少副作用的发生。实验基于中空纤维膜过滤系统，通过设定某些超过滤条件，纯化脱毒后无细胞百日咳疫苗原液，实验取得了令人满意的结果。
2 材料与方法
2.1样品
脱毒后的精制无细胞百日咳抗原溶液（以下简称脱毒后的抗原溶液）由菌苗室提供。生物指标、生长特性和毒性生产与目前所使用的菌种是相同的。
2.2主要试剂及仪器
培养基室提供注射用水;从国药集团北京生物制品研究所有限责任公司化学试剂有限公司购氯化钠，为药用级;透析袋购自美国Viskase公司;绵羊抗人PT血清和绵羊抗人FHA血清购自NIBSC公司;HRP标记的兔抗羊IgG购自KPL公司;层析填料S Sepharose Fast Flow（装填体积为500ml）购自GE公司。
2.3无细胞百日咳疫苗原液的超滤纯化
先将脱毒后的抗原溶液用 10 kD 形态超滤柱超滤浓缩 5 倍左右，然后开始洗滤，在滤出体积为4 ～ 5 倍时停止洗滤，用 1 倍滤体积的生理盐水对整个系统进行淋洗回收。精制抗原PBS打入脱毒罐，搅拌10分中，加入2.5%戊二醛，作用4小时后，加入10%赖氨酸，作用2小时（作为化学终止剂），在这两小时中把罐中原液平均分到透析袋里，再入透析槽，透析6天后，收集抗原，打入静置罐，再静置15天后，超声匀化，最后是无细胞百日咳疫苗原液。
2.4无细胞百日咳疫苗原液的透析纯化
透析袋具有一定的阻断分子量功能，比该分子量高的分子物质例如蛋白质不能通过，而某些较小的分子物质，如无机盐，则可以通过半渗透膜进行，该膜可以分离分子中的蛋白质分子。将无病毒抗原溶液包裹在透析袋中并置于0。5%。在85%无菌氯化钠溶液中，将抗原在2～8℃下透析，直至抗原为浅粉色。进行 10 倍体积脱盐预处理使用 0. 01 mol / L PB 缓冲液（pH 5. 8），确保低于 0. 65 mS / cm样品的电导值（25 ℃时的 0. 05 mol / LNaCl 溶液的电导率），离子交换层析上样液被制备成，并对超滤废液进行收集。透析时把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质逐渐降低到最小值为止。
2.5 纯化原液的鉴定
将超滤后和透析后的原液按比例还原至纯化前体积，对照样品为脱毒后的抗原溶液，分析样品的纯度使用12% SDS-PAGE。将各样品 10 000 × g 离心15 min，称量溶液中的固含量，计算回收率;测定透析后及超滤后原液的效价依照《中国药典》三部（2010 版）附录 2 。判定各洗脱组分的热原是否合格的标准采用《中国药典》三部（2005 版）附录“热原检测法”进行判定;电泳图谱中目的蛋白的纯度的分析使用 GelAnalyzer 软件。
3 结果
3.1 形态超滤浓缩和洗滤
70min内滤出4800ml料液由超滤浓缩过程产生，浓缩了5倍，滤速衰减平稳，平均滤速为42LMH（69.6ml/min）;在洗滤过程中，90min内滤出5300ml料液，洗滤倍数为4.4倍，滤速衰减基本平稳，平均滤速为36LMH（59.5ml/min）;随着发酵的增加，FHA的蛋白质含量逐步增加，在细菌中的浓度较低，变化不明显。调节菌液p H值至7.3和6.3時，菌液上清液中PT和FHA含量略有升高。将各纯化成分样品的Westernblot结果进行比较，pH为5.8的加样溶液经色谱柱吸附后，目标蛋白全部被完全捕获且无流动损失。并混合淋洗液与之前的洗滤液（1200ml），2.5倍为原液的最终浓缩倍数。透析法需要更换5次透析液，全过程约为6d。原液的颜色均为浅粉色，在两种方法纯化之后，标准符合《中国药典》三部（2010版）的规定。
3.2 纯化原液的鉴定
依据SDS-PAGE分析结果显示，无细胞百日咳疫苗原液的纯度改变不明显，在经过形态超滤和透析法纯化之后。具有良好的重复性对于建立的纯化新工艺，可达90%以上的目的蛋白回收率，热原均合格经过动物试验检测后。透析纯化略高于超滤纯化的回收率，见表1;超滤纯化的原液效价（11.166IU/ml）高于透析纯化的原液效价（9.211IU/ml），二者均达到《中国药典》三部（2010版）规定的标准（>8.0IU/ml）。 4 讨论
作为用于大分子物质的分离、浓缩和提纯的一种膜分离技术，形态超滤在食品、发酵、医药、环保、化工等行业都有广泛运用。在收获后的浓缩和脱盐作业中，由于膜包的固定大小，对蛋白质的吸附不那么恒定，如果发酵扩大，这一步骤的损失可以明显减少。本文对脱毒后的无细胞百日咳抗原溶液进行纯化使用形态超滤技术，在纯化效果、回收率、效价等方面与以往的透析方法进行了比较。结果表明，去除解毒剂和色谱法效果较好，收率较高，产率高于透析。在实际生产过程中，对不同的电源和液体组件的切向热过滤膜的非专用链路程度不同。在超过滤阶段，目标蛋白质的损失率低于20%。
通过高相色谱法纯化完成了从捕获和浓缩目标蛋白到分离和纯化多个成分的一步，有效缩短了整个下游过程的时间。切向过滤产生了一定的内聚蛋白作用，这对于减少粗心剂的形成是有用的，而透析和超过滤后的创新则是有益的。后者的絮凝蛋白更细腻，且沉降速度更缓慢，因此形态超滤可以提高后期超声波匀化效率，从而间接提高产品的效价。从超滤的外液中未检测到有效抗原，从物料平衡的角度考虑，抗原损失的原因不在于“泄漏”，很可能在于该组分“沉淀”在流体通道及与膜材质表面之间的黏附。下一步將尝试通过增加淋洗次数和增大溶液的离子强度等方法来提高抗原的回收率。
5 结论
由于具有流畅的纤维通道，中空纤维超滤膜柱允许高固含量的混浊物材料自由通脱，因而不发生通道阻塞的情况。临床观察显示，APV和DTAP的免疫效果与百日咳疫苗的免疫效果相似，副作用大大减少。在本实验中，建立了一种可线性放大工艺、以适应大规模的APV生产。应用形态超滤技术纯化无细胞百日咳抗原可替代透析工艺。为疫苗质量标准的提高奠定了基础。
参考文献
[1] 高振轩， 谌志筠， 何秋水. 无细胞百日咳疫苗时代百日咳杆菌黏附素蛋白缺失株的研究进展[J]. 医学综述， 2019， 25（13）.
[2] 潘殊男. 白喉-破伤风-无细胞百日咳-脊髓灰质炎灭活疫苗的临床免疫原性研究进展（续）[J]. 国际生物制品学杂志， 2019， 42（3）：143-146.
[3] 高娜. 响应面法建立层析纯化去除百日咳丝状血凝素中内毒素工艺[J]. 微生物学通报， 2018， 45（6）：1384-1392.
[4] 孟庆红， 史伟， 姚开虎. 百日咳自然感染和疫苗诱导的免疫反应研究进展[J]. 中华实用儿科临床杂志， 2017， 32（10）：794-796.