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摘要：建立HPLC测定荷叶配方颗粒中荷叶碱含量的方法。方法：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（27：70.6：1.6：0.8）为流动相；流速：1ml/min；检测波长为270nm；柱温：30℃。理论板数按荷叶碱峰计应不低于2000。结果：荷叶碱在0.0408～0.3072g 范围内具有良好的线性关系，r= 0.9999，平均回收率为97.39%，RSD=2.04%（n=6）。结论：本法简便、准确，灵敏度高，重复性好，可用于荷叶成分的含量测定。
关键词：荷叶 高效液相色谱 含量
中图分类号：R151 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）04-0022-02
荷叶为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn的叶。属于“既是食品又是药品”的物品，其在食用及药用两方面均有较广泛的应用[1]，具清热解暑、升发清阳、凉血止血之功[2-4]。《本草纲目》载“荷叶服之，令人瘦劣”[5]。民间有用荷叶治疗肥胖症的记载[6]。荷叶富含生物碱和黄酮类两大主要活性成分[7-9]。现代研究显示荷叶碱为荷叶中的主要降脂活性成分。荷叶配方颗粒是以荷叶饮片为原料，经过提取、分离、浓缩、干燥、制粒、包装等生产工艺，加工制成的一种新型配方用药，本实验采用高效液相色谱技术，对荷叶配方颗粒中的荷叶碱进行了含量测定。以期为荷叶资源进一步的开发和利用提供帮助。
1 仪器与试剂
高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱仪。
荷叶碱化学对照品：购自中国药品生物制品检定所提供，批号：111566-201208，规格：20mg。其他所用试剂均为色谱纯和分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液制备
取荷叶碱对照品10.2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得荷叶碱对照品的储备液；吸取1ml储备液，置于10ml量瓶中，加甲醇定容，即得（每1ml含荷叶碱20.4g）。
2.1.2 供试品溶液制备
取荷叶干膏适量，研磨，精密称取0.5g，置具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞后称定重量，超声处理30分钟，取出放冷后，称定，补足减失的重量，滤过，取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇，摇匀，即得。
2.2 色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（依利特 4.6mm×250mm）。流动相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（27：70.6：1.6：0.8）。检测波长：270nm。流速：1ml/min。柱温：30℃。理论板数：按荷叶碱峰计，应不低于2000。
2.3 线性关系考察
精密吸取系列对照品溶液依次为2ul、4ul、8ul、12ul、16ul、18ul，注入液相色谱仪中，并以进样量（g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性关系考察，并绘制标准曲线，计算回归方程：y=3959.2x-5.3897，r=0.9999，说明荷叶碱在0.0408～0.3072g范围内呈良好的线性关系。
2.4 精密度考察
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20l，连续进样6次，依法测定，记录峰面积积分值，计算，考察精密度，叶碱峰面积的平均值为1739.517，RSD为0.34%。
2.5 稳定性考察
精密吸取同一供试品溶液及对照品溶液各20l，每隔一定时间分别注入液相色谱仪，依法测定，以荷叶碱峰面积积分值为指标，进行稳定性考察。结果显示对照品溶液和供试品溶液在24小时内测定结果的RSD值分别为0.52%、1.62%，表明荷叶碱的稳定性良好，即24小时内测定结果可靠。
2.6 重复性试验
精密称取同一批样品6份，按供2.1.2溶液项下制备，独立测定，计算样品含量用以考察重复性，以荷叶碱含量为测定指标，考察本法重现性，结果显示RSD值为2.46%，平均含量为0.3463mg/g，表明该方法重现性良好。
2.7 加样回收率
精密称取测定的已知含量样品6份，分别精密加入对照品适量，依法测定，计算回收率，结果显示平均回收率为 97.39%，RSD值为2.04%，表明本法准确性较好，方法可行。
2.8 样品含量测定
取十批样品（每袋1g），依法制备供试品溶液，每批二份，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20l，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算十批样品中荷叶碱含量。
3 讨论
溶剂提取的过程是由润湿、渗透、解吸、溶解及扩散、置换等几个相互联系的作用综合而成。对药材进行提取时，药材经粉碎后，一部分细胞会破裂，其中成分可直接扩散到溶剂中，但大部分细胞在粉碎后仍保持完整，提取溶剂需要穿透细胞壁进入到细胞质中将成分浸出，因此荷叶药材在含量测定的供试品溶液即采用热提法，目的是提高提取效率，以保证指标成分的溶出率。因此供试品溶液Ⅱ的提取方法拟以甲醇作为提取溶剂，采用超声提取法代替加热回流提取，达到即可保证有效成分的提取率，又能使检验过程更方便快捷。
参考文献
[1]李健英，华英圣，闰刚.菊荷冲剂对高脂血症大鼠血脂代谢的研究[J].中国中医药科技，1998，5（2）：113-116.
[2]Ch P（中国药典） [S].VolⅠ.2000.
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：化学工业出版社版，2005：195.
[4]杨鹏，陈希平，文宁.HPLC法测定不同产地和采收期荷叶中芦丁和荷叶碱的含量[B].湖南中医药大学学报，30（3）：37-40.
[5]蔡为荣.微波提取荷叶黄酮及其清除羟基自由基的研究[J].食品科学，2004，5（9）：112-114.
[6]XuLa-ying（许腊英），LIUYun-gou（刘运苟），YE Ze-xiu（叶泽秀）， ef al.Development and research of effect on lowering hyper-lipemia of Nelumbo nucifera leaves（荷叶降血脂的开发研究）.Hubei J Tradit Chin med（湖北中医杂志），1996，18（1）：42.
[7]黄阿根，施洪飞，韦红，等.荷叶黄酮和生物碱的提纯及调节血脂作用比较[J].扬州大学烹饪学报，2006，（3）：23-25.
[8]Min Hu，Leif H.Skibsted.Antioxidative capacity of rhizome ex-tract and rhizome knot extract of edible lotus（Nelumbo nufieera）[J].Food Chem，2002，76：327-333.
[9]邓胜国，邓泽元，黄丽.荷叶黄酮体外抗氧化活性的研究[J].食品科技，2006，（7）：274-276.
关键词：荷叶 高效液相色谱 含量
中图分类号：R151 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）04-0022-02
荷叶为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn的叶。属于“既是食品又是药品”的物品，其在食用及药用两方面均有较广泛的应用[1]，具清热解暑、升发清阳、凉血止血之功[2-4]。《本草纲目》载“荷叶服之，令人瘦劣”[5]。民间有用荷叶治疗肥胖症的记载[6]。荷叶富含生物碱和黄酮类两大主要活性成分[7-9]。现代研究显示荷叶碱为荷叶中的主要降脂活性成分。荷叶配方颗粒是以荷叶饮片为原料，经过提取、分离、浓缩、干燥、制粒、包装等生产工艺，加工制成的一种新型配方用药，本实验采用高效液相色谱技术，对荷叶配方颗粒中的荷叶碱进行了含量测定。以期为荷叶资源进一步的开发和利用提供帮助。
1 仪器与试剂
高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱仪。
荷叶碱化学对照品：购自中国药品生物制品检定所提供，批号：111566-201208，规格：20mg。其他所用试剂均为色谱纯和分析纯。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液制备
取荷叶碱对照品10.2mg，精密称定，置50ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得荷叶碱对照品的储备液；吸取1ml储备液，置于10ml量瓶中，加甲醇定容，即得（每1ml含荷叶碱20.4g）。
2.1.2 供试品溶液制备
取荷叶干膏适量，研磨，精密称取0.5g，置具塞三角烧瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞后称定重量，超声处理30分钟，取出放冷后，称定，补足减失的重量，滤过，取续滤液5ml，置10ml量瓶中，加甲醇，摇匀，即得。
2.2 色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（依利特 4.6mm×250mm）。流动相：乙腈-水-三乙胺-冰醋酸（27：70.6：1.6：0.8）。检测波长：270nm。流速：1ml/min。柱温：30℃。理论板数：按荷叶碱峰计，应不低于2000。
2.3 线性关系考察
精密吸取系列对照品溶液依次为2ul、4ul、8ul、12ul、16ul、18ul，注入液相色谱仪中，并以进样量（g）为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，进行线性关系考察，并绘制标准曲线，计算回归方程：y=3959.2x-5.3897，r=0.9999，说明荷叶碱在0.0408～0.3072g范围内呈良好的线性关系。
2.4 精密度考察
精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20l，连续进样6次，依法测定，记录峰面积积分值，计算，考察精密度，叶碱峰面积的平均值为1739.517，RSD为0.34%。
2.5 稳定性考察
精密吸取同一供试品溶液及对照品溶液各20l，每隔一定时间分别注入液相色谱仪，依法测定，以荷叶碱峰面积积分值为指标，进行稳定性考察。结果显示对照品溶液和供试品溶液在24小时内测定结果的RSD值分别为0.52%、1.62%，表明荷叶碱的稳定性良好，即24小时内测定结果可靠。
2.6 重复性试验
精密称取同一批样品6份，按供2.1.2溶液项下制备，独立测定，计算样品含量用以考察重复性，以荷叶碱含量为测定指标，考察本法重现性，结果显示RSD值为2.46%，平均含量为0.3463mg/g，表明该方法重现性良好。
2.7 加样回收率
精密称取测定的已知含量样品6份，分别精密加入对照品适量，依法测定，计算回收率，结果显示平均回收率为 97.39%，RSD值为2.04%，表明本法准确性较好，方法可行。
2.8 样品含量测定
取十批样品（每袋1g），依法制备供试品溶液，每批二份，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各20l，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算十批样品中荷叶碱含量。
3 讨论
溶剂提取的过程是由润湿、渗透、解吸、溶解及扩散、置换等几个相互联系的作用综合而成。对药材进行提取时，药材经粉碎后，一部分细胞会破裂，其中成分可直接扩散到溶剂中，但大部分细胞在粉碎后仍保持完整，提取溶剂需要穿透细胞壁进入到细胞质中将成分浸出，因此荷叶药材在含量测定的供试品溶液即采用热提法，目的是提高提取效率，以保证指标成分的溶出率。因此供试品溶液Ⅱ的提取方法拟以甲醇作为提取溶剂，采用超声提取法代替加热回流提取，达到即可保证有效成分的提取率，又能使检验过程更方便快捷。
参考文献
[1]李健英，华英圣，闰刚.菊荷冲剂对高脂血症大鼠血脂代谢的研究[J].中国中医药科技，1998，5（2）：113-116.
[2]Ch P（中国药典） [S].VolⅠ.2000.
[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：化学工业出版社版，2005：195.
[4]杨鹏，陈希平，文宁.HPLC法测定不同产地和采收期荷叶中芦丁和荷叶碱的含量[B].湖南中医药大学学报，30（3）：37-40.
[5]蔡为荣.微波提取荷叶黄酮及其清除羟基自由基的研究[J].食品科学，2004，5（9）：112-114.
[6]XuLa-ying（许腊英），LIUYun-gou（刘运苟），YE Ze-xiu（叶泽秀）， ef al.Development and research of effect on lowering hyper-lipemia of Nelumbo nucifera leaves（荷叶降血脂的开发研究）.Hubei J Tradit Chin med（湖北中医杂志），1996，18（1）：42.
[7]黄阿根，施洪飞，韦红，等.荷叶黄酮和生物碱的提纯及调节血脂作用比较[J].扬州大学烹饪学报，2006，（3）：23-25.
[8]Min Hu，Leif H.Skibsted.Antioxidative capacity of rhizome ex-tract and rhizome knot extract of edible lotus（Nelumbo nufieera）[J].Food Chem，2002，76：327-333.
[9]邓胜国，邓泽元，黄丽.荷叶黄酮体外抗氧化活性的研究[J].食品科技，2006，（7）：274-276.