将目的基因安全、有效地导入并使其适度表达是基因治疗的关键。病毒载体具有潜在的致病性、免疫原性及致突变性等缺点,而非病毒载体以其安全、价廉、灵活性成为目前研究的热点。目前,O-羧甲基壳聚糖十八烷基季铵盐/胆固醇(OQLCS/chol)脂质体作为基因载体的相关研究鲜见报道。
目的研究OQLCS/chol脂质体的性能及其作为非病毒载体的最适转染条件。
方法常规培养人视网膜色素上皮(RPE)细胞株;根据GeneBank人(NM-00171626)血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的已知序列制备和抽提质粒DNA,采用电泳阻滞法研究OQLCS/chol脂质体与质粒DNA在不同质量比、不同作用时间及是否存在血清等条件下的包载效能,筛选最优转染条件;采用高速离心法进行体外释放动力学实验,绘制体外释放曲线;将培养的细胞分为OQLCS/chol脂质体组和Lipo2000组,采用共培养法分别用OQLCS/chol脂质体和Lipo2000转染RPE细胞,采用绿色荧光蛋白(GFP)染色法比较和评价其转染效率;利用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测OQLCS/chol脂质体转染后RPE细胞的存活率,确定OQLCS/chol脂质体的最佳转染安全质量浓度。
结果OQLCS/chol脂质体纳米粒平均有效粒径为134 nm,Zeta电位为+39.64 mV。体外释放实验显示,载质粒DNA的OQLCS/chol脂质体的体外快速释放相在最初5 d,质粒释放量约为70.0%,至14 d缓释量呈稳态相。OQLCS/chol的最高安全质量浓度为20 μg/ml,OQLCS/chol与质粒DNA质量比≥2∶1、混合时间为30~40 min、无血清培养条件下转染条件为最优。载质粒DNA的OQLCS/chol脂质体转染组RPE细胞转染率为71.05%,Lipo2000转染组为70.58%,差异无统计学意义(χ2=0.534,P=0.465)。
结论自行制备的跨膜肽修饰的OQLCS/chol脂质体具有粒径均匀、分散性好、Zeta电位高、细胞毒性小、能在较短时间释放达到治疗质量浓度的基因且后续可缓慢平稳释放等特性。OQLCS/chol脂质体将VEGFsiRNA转染到RPE细胞的转染效率与Lipo2000接近。